Efeitos fisiológicos e genotóxicos induzidos por contaminantes ambientais em peixes

Abstract

No presente trabalho foi estudado um largo espectro de efeitos fisiológicos e genotóxicos induzidos pela exposição de três espécies de teleósteos - Anguilla anguilla L. (enguia Europeia), Dicentrarchus labrax L. (robalo) e Sparus aurata L. (dourada) a contaminantes aquáticos. Exposições de curta duração foram realizadas de acordo com três (1, 2, 3) perspectivas distintas: (1) Exposições laboratoriais a contaminantes isolados (capítulos II a VI), nomeadamente aos ácidos abiético e desidroabiético, reteno, naftaleno, β-naftoflavona (BNF) e 17β-estradiol (E2). Estas exposições causaram, maioritariamente, uma desregulação endócrina, expressa através da incapacidade dos peixes elevarem o cortisol no plasma face a situações de stresse, exceptuando a exposição a ácido abiético que induziu um aumento desta hormona e a BNF que não causou nenhuma alteração deste parâmetro. Os níveis plasmáticos de glucose e lactato foram determinados como respostas secundárias de stresse para todos os compostos anteriormente referidos, excluindo o naftaleno. Os peixes expostos a ácidos resínicos apresentaram um aumento dos dois parâmetros anteriores correspondente a um padrão de resposta típica de stresse. Contudo, o reteno e a BNF induziram aumentos unicamente na concentração de glucose plasmática. A exposição de A. anguilla a BNF também revelou um decréscimo da concentração de tiroxina (T4) no plasma. A capacidade do E2 induzir a síntese de vitelogenina (Vtg) em D. labrax juvenis e a sua relação com os níveis de E2 no plasma, foram avaliada no capítulo VI, adoptando duas vias de exposição diferentes: diluição na água ou injecção intraperitoneal (i.p.). A indução de Vtg foi verificada nos dois casos, tendo sido detectado um aumento concomitante de E2 no plasma apenas para a exposição via água. O naftaleno e a BNF foram capazes de induzir a biotransformação hepática, medida através do aumento da actividade da etoxiresorufina-O-desetilase (EROD) (fase I) (capítulo III). Apesar da capacidade destes compostos induzirem a actividade EROD, eles revelaram uma capacidade inibitória, especialmente para as concentrações mais elevadas e durante as primeiras horas de exposição. O naftaleno revelou ser também um indutor da actividade da glutationa-S-transferase (GST) (fase II). A resposta genotóxica de A. anguilla variou claramente com o composto testado. Assim, as propriedades genotóxicas do naftaleno foram demonstradas através de um aumento da frequência de anomalias nucleares eritrocíticas (ANE), enquanto que a BNFnão provocou qualquer alteração deste parâmetro (capítulo III). A exposição de D. labrax a E2 resultou no aumento da frequência de ANE, demonstrando o seu potencial genotóxico (capítulo V). Os compostos testados nos capítulos II a VI revelaram uma grande variedade de efeitos adversos, reafirmando o risco ecológico que representam. (2) Exposições laboratoriais de D. labrax, A. anguilla e S. aurata a misturas simples ou exposições sequenciais a diferentes contaminantes (capítulos VII a IX). Os níveis plasmáticos de cortisol e glucose foram quantificados em todos estes capítulos. Um decréscimo significativo de cortisol foi observado em S. aurata exposta a E2+nonilfenol (NP) (capítulo VII), sinalizando uma desregulação endócrina. A pré-exposição a BNF exerceu uma acção antagonista sobre a capacidade do cobre (Cu) aumentar o cortisol em A. anguilla (capítulo IX). Todas as respostas obtidas revelaram um aumento da glucose, tendo ainda sido verificada uma acção sinergística no caso da exposição de D. labrax a BNF+NP e de A. anguilla a BNF+100 μM crómio (Cr). Contudo, a BNF demonstrou diminuir a capacidade do E2 elevar a glucose plasmática. O lactato plasmático (capítulos VIII e IX), de um modo geral, permaneceu inalterado, tendo-se observado um aumento apenas no caso de E2+NP. No entanto, observou-se uma acção antagonista da BNF, impedindo o aumento de lactato no plasma de A. anguilla em resultado da exposição a Cu. A frequência de ANE foi avaliada nos capítulos VII a IX. A exposição de D. labrax a BNF+E2 e a BNF+NP induziu um aumento da frequência de ANE. A exposição de A. anguilla a BNF+Cu demonstrou igualmente o seu potencial genotóxico, revelando uma acção sinergística. O conteúdo hepático em citocromo P450, as actividades EROD, GST e alanina aminotransferase (ALT) no fígado, bem como o índice hepato-somático (IHS) foram determinados nos capítulos VII e VIII. O E2 e o NP reduziram a actividade de EROD induzida pela BNF em D. labrax. De forma semelhante, a mistura de E2+NP teve a capacidade de afectar a expressão constitutiva do CYP1A, medida pela diminuição de EROD em S. aurata. A importância da mistura de compostos foi reforçada através da redução da actividade de GST observada após exposição a BNF+NP, uma vez que estes compostos isoladamente não demonstraram essa capacidade (capítulo VII). Contudo, no capítulo VIII, detectou-se um aumento de GST para a mistura E2+NP, possivelmente devido à acção individual do E2. Um decréscimo de T4 plasmático foi observado em A. anguilla exposta a BNF+Cr e BNF+Cu, sugerindo uma acção sinergística entre BNF e Cu, em que a pré-exposição acentuou o efeito do Cu (capítulo IX). A importância da pré-exposição a BNF na acção do Cr e do Cu sobre os níveis T3 plasmático não foi detectada; embora, a interferência dessa pré-exposição não possa ser excluída no caso da exposição a 100 μM Cr. (3) A terceira e última perspectiva disse respeito a exposições in situ em três ecossistemas aquáticos diferentes (capítulos X e XI). Estudou-se uma zona portuária, situada na Ria de Aveiro, tipicamente contaminada por hidrocarbonetos aromáticos policíclicos, metais pesados e compostos organoestânicos. A zona do rio Vouga situada a 13 Km da sua foz, receptora do efluente de uma unidade de produção de pasta de papel durante quase 5 décadas foi também estudada. Neste segundo local, foi avaliada a recuperação do ecossistema após o desvio do efluente, de acordo com os efeitos observados. Por fim, seleccionou-se um ecossistema de água doce – Pateira de Fermentelos –por ser uma bacia receptora de efluentes domésticos e industriais, bem como de lixiviados agrícolas. Em qualquer das áreas de estudo foram avaliados indicadores de stresse como cortisol, glucose e lactato plasmáticos. Um conjunto de parâmetros relativos à biotransformação, genotoxicidade, hormonas do eixo hipotálamo-pituitária-tiróide (HPT) e E2 no plasma foram também determinados após exposição na Pateira de Fermentelos (capítulo XI). Os indicadores de stresse mostraram alterações que se enquadram no perfil típico de resposta, ou seja aumento simultâneo de cortisol, glucose e lactato, nos três ecossistemas avaliados, com excepção do lactato que se manteve inalterado no caso da exposição na Pateira de Fermentelos. Os dados relativos ao rio Vouga revelaram alterações de stresse em A. anguilla, 2 anos após o desvio do efluente, indicando a persistência de contaminantes nos respectivos sedimentos. Na Pateira de Fermentelos observou-se uma tendência geral para a diminuição de T3, confirmada com o decréscimo significativo no local mais próximo da principal fonte de poluição, sem ser contudo acompanhada por alterações de TSH e T4. No que diz respeito ao E2, observou-se um aumento significativo em 2 locais da Pateira de Fermentelos, indicando a presença desta hormona “natural” em níveis elevados na água. Os parâmetros relativos à biotransformação e genotoxicidade permaneceram inalterados. Os resultados obtidos nas exposições in situ na Pateira de Fermentelos forneceram fortes indicações da contaminação deste ecossistema. Globalmente, os dados da presente tese permitem um melhor conhecimento do potencial tóxico de diferentes compostos de grande relevância ambiental, cuja importância surge acrescida pela escassez de informação disponível no que respeita aos parâmetros estudados. Os dados apresentados contribuíram também para um melhor conhecimento das respostas toxicológicas em peixes, particularmente como resultado do uso de uma bateria de biomarcadores que fornecem evidências das interferências de diferentes classes de xenobióticos, quer em misturas, quer em exposições sequenciais.

In the present work a wide range of physiological and genotoxic effects due to aquatic contaminants exposure was studied, adopting three teleost species -Anguilla anguilla L. (European eel), Dicentrarchus labrax L. (sea bass) e Sparus aurata L. (sea bream). Short-term exposures were carried out, according to three (1, 2, 3) different approaches: (1) Laboratorial exposures to individual compounds (chapters II to VI), namely to abietic and dehydroabietic acids, retene, naphthalene, β-nahthoflavone (BNF) and 17β-estradiol (E2). The large majority of the previous exposures cause endocrine disruption, expressed through fish inability to elevate plasma cortisol under stress conditions, with the exception for abietic acid exposure, which induced an increase in this hormone and BNF that did not cause any alteration. Glucose and lactate plasmatic concentrations were determined, as secondary stress responses, for all the previous mentioned compounds except for naphthalene. Thus, fish exposed to resin acids presented a raise in both parameters corresponding to a typical stress pattern response. Though, retene and BNF only increased the plasma glucose concentration. A. anguilla BNF exposure also revealed a decrease in plasma thyroxine (T4) concentration. In chapter VI, the E2 ability to induce vitellogenin (Vtg) synthesis in juvenile D. labrax was evaluated in relation with E2 levels in plasma, adopting two different exposure routes: water diluted or intraperitoneally (i.p.) injected. A plasma Vtg increase was observed under both exposure conditions, though E2 plasma increase was only significant for waterborne exposure. Naphthalene and BNF demonstrated its ability to induce hepatic biotransformation, measured as an increased ethoxyresorufin-O-deethylase (EROD) activity (phase I) (chapter III). Despite these compounds EROD activity inducing capacity, it also revealed inhibition ability, especially for the highest concentrations and during the first exposure hours. Naphthalene also revealed its capacity as a glutathione S-transferase (GST) inducer (phase II). A. anguilla genotoxicity response clearly varied with the tested compound. Thus, naphthalene has demonstrated its genotoxic properties by inducing erythrocytic nuclear abnormalities (ENA) increase, whereas BNF did not alter this parameter (chapter III). D. labrax E2exposure induced an increase in ENA frequency, demonstrating its genotoxic potential (chapter V). Globally, the compounds tested in chapters II to VI revealed a wide variety of adverse effects, corroborating the ecological risk they represent. (2) Laboratorial exposures to simple mixtures or sequential exposures to different contaminants in D. labrax, A. anguilla e S. aurata (chapters VII to IX). In any of the previous chapters, plasma cortisol and glucose levels were assessed. A significant plasma cortisol decrease was observed in S. aurata after E2+nonylphenol (NP) exposure (chapter VII), signalling an endocrine disruption. BNF preexposure exerted an antagonistic action over copper (Cu) ability to induce cortisol increase in A. anguilla (chapter IX). Though all the plasma glucose responses observed revealed an increase, a synergistic action after D. labrax exposure to BNF+NP and A. anguilla exposure to BNF+100 μM chromium (Cr) was also observed. Nevertheless, BNF showed to limit the E2 capability of elevating plasma glucose. In general, plasma lactate (chapters VIII and IX) remained unaltered, though its increase was observed only after E2+NP exposure. A BNF antagonistic action preventing the plasma lactate increase in A. anguilla due to Cu exposure was detected. ENA frequency was assessed in the chapters VII to IX. D. labrax exposure to BNF+E2 and BNF+NP induced an ENA frequency increase. A. anguilla exposure to BNF+Cu also demonstrated its genotoxic potential, revealing a synergistic action. In chapters VII and VIII liver cytochrome P450 content, liver EROD, GST and alanine transaminase (ALT) activities, as well as hepato-somatic index (HSI) were measured. E2 and NP reduced the BNF EROD activity induction in D. labrax. The E2+NP mixture had the ability to reduce the constitutive expression of CYP1A, measured as EROD activity in S. aurata. The importance of compound mixtures was supported by the GST activity reduction, observed after exposure to BNF+NP, since each of these compounds isolated does not induce the same effect (chapter VII). Though, in chapter VIII, a GST increase was detected for the mixture E2+NP, probably due to E2 individual action. In chapter IX, an A. anguilla plasma T4 decrease was observed after BNF+Cr and BNF+Cu exposures, suggesting a synergistic action between BNF and Cu since the preexposure enhaced Cu effect. The BNF preexposure over Cr or Cu action on plasma T3 was not observed; though, its importance cannot be excluded considering the 100 μM Cr exposure. (3) The third and last approach concerned in situ exposures in three different aquatic ecosystems (chapters X and XI). An offward fishing harbour located at the Ria de Aveiro, typically contaminated by polycyclic aromatic hydrocarbons, heavy metals and organometallics, was studied. An area situated 13 Km upstream from River Vouga mouth was also studied, considering its contamination for several decades as a receptor of a paper and pulp mill effluent. In this second area the contamination cleanup process after the effluent deviation was evaluated, according to the effects observed. Finally, a freshwater ecosystem was also selected – Pateira de Fermentelos – as a recipient of domestic and industrial effluents, agriculture runoff. Stress indicators such as plasma cortisol, glucose and lactate were determined in A. anguilla under exposure. A set of parameters concerning biotransformation, genotoxicity, HPT axis hormones and E2 in plasma was also measured in A. anguilla after exposure at the Pateira de Fermentelos (chapter XI). The simultaneous increase in cortisol, glucose and lactate fit in the typical profile of response to stress indicators in the three evaluated ecosystems, with an exception for plasma lactate that remains unaltered after Pateira de Fermentelos exposure. The data concerning rio Vouga revealed that 2 years after the effluent deviation, contaminants were still able to induce stress alterations in A. anguilla indicating its persistence in the sediments. A general tendency for plasma T3 reduction was observed at the Pateira de Fermentelos and confirmed by its significant decrease at the closest site to the main pollution source. A significant E2 increase was observed in 2 sites of Pateira de Fermentelos, indicating the presence of this natural “hormone” in elevated levels in water. The parameters related to biotransformation and genotoxicity remained unaltered. The results concerning A. anguilla Pateira de Fermentelos in situ exposure provided strong indication of this ecosystem contamination. Globally, the data concerning the present thesis allow a better knowledge of the toxic potential of different compounds with environmental relevancy. These results also contribute to a better understanding of fish toxicological responses particularly resulting from the use of a biomarker battery that give us the evidence of different classes of xenobiotics interference in mixtures as well as in sequential exposures.