Phosphorylation-dependent Alzheimer's Amyloid precursor protein (APP) targeting

Abstract

A Doença de Alzheimer (DA) é uma das doenças neurodegenerativas mais comuns, e apresenta uma incidência mundial de 2-7% em indivíduos com mais de 65 anos e de cerca de 15% em indivíduos acima dos 85 anos de idade. Apesar da sua etiologia multifactorial, há uma correlação bem descrita entre esta patologia e um peptídeo neurotóxico denominado Abeta. Este peptídeo deriva fisiológica e proteoliticamente de uma glicoproteína transmembranar com características de receptor: a Proteína Percursora de Amilóide de Alzheimer (PPA). As possíveis funções fisiológicas da proteína PPA, o seu destino e vias de processamento celulares, conjuntamente com possíveis proteínas celulares que com ela interajam, são assim tópicos de interesse e objectos de investigação científica mundial. Neste contexto tem sido amplamente descrito o envolvimento do processo de fosforilação de proteínas, uma importante modificação pós-transducional que regula muitos e variados acontecimentos intracelulares, na regulação do processamento da PPA. Apesar do exposto, muito pouco é conhecido acerca da fosforilação directa da própria PPA. Esta proteína possui na sua estrutura primária sequências consenso para fosforilação, quer no seu ectodomínio quer no seu domínio intracelular, já descritas como sofrendo fosforilação “in vitro” e “in vivo”. O resíduo Serina 655 pertence a um motivo funcional da APP, 653YTSI656, que forma um sinal de internalização e/ou de “sorting” basolateral. Este domínio é também o local de ligação para a APPBP2, uma proteína que interage com os microtubulos da célula. Embora ainda mal elucidados, os mecanismos pelos quais a fosforilação proteica regula o processamento da PPA parecem incluir uma alteração no tráfego desta proteína, sugerindo que o domínio fosforilável 653YTSI656 desempenha um papel importante nesse processo. Esta dissertação visou assim contribuir para elucidar o papel da fosforilação directa da molécula de APP, mais especificamente no seu resíduo Serina 655, na regulação do direcionamento e tráfego subcelular da proteína, e nas suas possíveis clivagens proteolíticas. De forma a respondermos a essas questões desenvolvemos um modelo experimental para seguir o tráfego intracelular, que usa uma combinação de biologia molecular, técnicas de microscopia de epifluorescência e técnicas de cultura celular. Os resultados obtidos implicam este resíduo como um sinal de direcionamento subcelular da proteína APP, e revelam como o redireccionamento desta proteína por fosforilação favorece um tipo de processamento não amiloidogénico desta. Adicionalmente, a fosforilação do resíduo Serina 655 parece possuir um papel regulador da actividade da PPA como molécula de transdução de sinais. As implicações destas observações na DA e em novas aplicações terapêuticas para a doença são subsequentemente discutidas.

Alzheimer’s Disease (AD) is a common neurodegenerative disease affecting individuals worldwide with an incidence of 2-7% of post-65 and 15% of post-85 years old. This disease is multifactorial in its etiology but central to its pathology is a neurotoxic peptide termed Abeta. This peptide is physiologically derived by a proteolytic process on the transmembranar Alzheimer’s Amyloid Precursor Protein (APP). Protein phosphorylation-dependent APP processing has been widely described and although the mechanisms involved remain far from clarified, alterations in APP trafficking seem to occur as part of the answer. Furthermore, the occurrence of consensus phosphorylation sites in the APP intracellular domain has been known for long, but little was known regarding the direct phosphorylation of APP. Efforts in unravelling the role of these domains are finally being successful in placing them as key control points in APP targeting and processing. Among these consensus sequences, the less studied 653YTSI656 motif forms a characteristic internalisation and/or basolateral sorting signal sequence, and is known to be the binding site for a microtubuleinteracting protein (APPBP2). Phosphorylation of this motif was thus suggested to be involved in APP targeting regulation, hitherto all attempts failed to confirm it or even to reveal substantial evidences. In this project, the role of the 653YTSI656 idomain, and in particular the phosphorylatable serine 655, in APP trafficking and proteolytic processing was studied. In order to address this question a new experimental methodology was developed, which coupled molecular biology, fluorescence imaging, and cell culture techniques. APP point mutants, mimicking serine 655 phosphorylatedand dephosphorylated-status, and tagged with the green-fluorescent protein, were used to study protein trafficking dynamics and processing. Results obtained place serine 655 phosphorylation as a key signal in APP sorting and targeting to specific subcellular locations. Also of high relevance was the observed implication of serine 655 phosphorylation as a regulatory mechanism that maybe involved in controlling APP function as a signal transducer. The implications of these observations in AD pathogenesis and therapeutic approaches are discussed.