Photoinactivation of bioluminescent bacteria by porphyrinic compounds

Abstract

A terapia fotodinâmica antimicrobiana representa uma alternativa promissora para inactivar eficientemente microrganismos patogénicos como bactérias, vírus, fungos e protozoários. Esta terapia baseia-se na utilização de um fotossensibilizador, que quando é activado por luz, gera espécies citotóxicas que destroem as células-alvo. A inactivação fotodinâmica das células microbianas pode ocorrer através de dois mecanismos oxidativos: a via do tipo I que envolve reacções de transferência de electrões/átomos de hidrogénio do fotossensibilizador com produção de radicais iónicos e a via do tipo II que envolve a transferência de energia do fotossensibilizador para oxigénio molecular com a subsequente formação de oxigénio singuleto. Tendo em conta os mecanismos de inactivação envolvidos no processo fotodinâmico das células microbianas alvo, o aparecimento de estratégias de resistência à terapia fotodinâmica e a recuperação da viabilidade microbiana parecem ser improváveis. O objectivo deste trabalho foi investigar o(s) mecanismo(s) envolvido(s) na inactivação fotodinâmica da bactéria recombinante bioluminescente Escherichia coli, utilizando três porfirinas catiónicas meso-substituídas como fotossensibilizadores. Foi também avaliada a possibilidade de recuperação da viabilidade bacteriana após fotoinactivação e a probabilidade de desenvolvimento de resistência bacteriana à terapia fotodinâmica antimicrobiana, utilizando duas bactérias Gram-negativas: Vibrio fischeri e E. coli bioluminescente. Para investigar o(s) mecanismo(s) de fotoinactivação dos três fotossensibilizadores, foram usados vários inibidores de oxigénio singuleto e de radicais livres. Suspensões de E. coli a 107 UFC mL-1 foram distribuídas em copos esterilizados e adicionadas de porfirina à concentração final de 5.0 μM para os derivados porfirínicos Tetra-Py+-Me e Tri-SPy+-Me-PF e 0.5 μM para a porfirina Tri-Py+-Me-PF. Para testar o mecanismo do tipo I foram usados como inibidores de radicais livres L-cisteína e D-manitol (100 mM). Para testar o mecanismo do tipo II foi usada a azida sódica (100 mM) como inibidor do oxigénio singuleto. As amostras foram expostas durante 270 minutos à luz branca (4 mW cm-2). A recuperação bacteriana foi testada através de um ensaio de fotoinactivação de 270 minutos a luz branca (4 mW cm-2) expondo as as suspensões bacterianas de V. fischeri e E. coli a 5.0 μM do derivado porfirínico Tri-Py+-Me-PF e mantendo as amostras no escuro durante uma semana de incubação após o tratamento. Para avaliar o possível desenvolvimento de resistência pelas células bacterianas à terapia fotodinâmica, suspensões bacterianas de V. fischeri e de E. coli foram expostas a luz branca (4 mW cm-2) durante 25 minutos com 5.0 μM de porfirina Tri-Py+-Me-PF. Colónias isoladas de células sobreviventes após o primeiro tratamento foram novamente expostas à luz visível usando o mesmo protocolo de irradiação. Este procedimento foi repetido dez vezes para cada estirpe. Os resultados obtidos neste trabalho indicam que as reacções mediadas pelo oxigénio singuleto (mecanismo do tipo II) têm um papel predominante sobre o mecanismo do tipo I no processo de fotoinactivção da bactéria bioluminescente E. coli pelos derivados Tri-Py+-Me-PF, Tetra-Py+-Me e Tri-SPy+-Me-PF. As bactérias inactivadas através da terapia fotodinâmica não recuperaram a sua actividade após uma semana de incubação no escuro. As estirpes V. fischeri e E. coli não desenvolveram resistência a esta terapia ao fim de dez gerações. Apesar do uso de inibidores representar um método simples e eficiente para determinar qual(is) a(s) via(s) implicada(s) no processo de inactivação fotodinâmica, a escolha dos inibidores deve ter em conta a estrutura química do fotossensibilizador. A ausência de desenvolvimento de resistência bacteriana e a não recuperação da viabilidade bacteriana após uma semana de incubação indica que a terapia fotodinâmica antimicrobiana representa um método adequado para inactivar bactérias de forma eficaz usando Tri-Py+-Me-PF.

The antimicrobial photodynamic therapy seems to be a very promising possibility for the efficient inactivation of pathogenic microorganisms and it has been demonstrated in bacteria, virus, fungi and protozoa. The concept of this therapy is that a photosensitizer localized in the target cells, when activated by light, generates cytotoxic species that destroy those cells. Two oxidative mechanisms of photoinactivation are considered to be implicated in the inactivation of the target cells: the type I pathway that involves electron/hydrogen atom-transfer reactions to produce radical ions and the type II pathway that involves energy transfer to produce singlet oxygen from molecular oxygen. Having into consideration the type of damages that occur in the microorganisms after the photoinactivation process, the emergence of strategies of resistance to photodynamic therapy and microbial recovery seem to be unlikely. The aim of this work was to investigate the mechanism(s) involved in the photodynamic inactivation of a recombinant bioluminescent Escherichia coli, using three meso-substituted cationic porphyrin derivatives as photosensitizers. It was also evaluated in this study the possible recovery of bacterial viability after photodynamic inactivation and the probable development of bacterial resistance to antimicrobial photodynamic therapy using two Gram-negative bacteria: Vibrio fischeri and the bioluminescent E. coli. To investigate the mechanism(s) of photoinactivation of the three photosensitizers in study, various scavengers of singlet oxygen and of free radicals were used. Suspensions of E. coli at 107 CFU mL-1 were distributed in sterilized beakers and the porphyrins were added to a final concentration of 5.0 μM for the porphyrinic derivatives Tetra-Py+-Me and Tri-SPy+-Me-PF porphyrins and 0.5 μM for Tri-Py+-Me-PF porphyrin. To test type I mechanism L-cysteine (100 mM) and D-mannitol (100 mM) were used as free radical scavengers. To test type II mechanism, sodium azide (100 mM) was used as singlet oxygen quencher. The mixtures were exposed for 270 minutes to white light (4 mW cm-2). The bacterial recovery was tested with a photoinactivation assay of 270 minutes with white light (4 mW cm-2) exposing bacterial suspensions of V. fischeri and E. coli to 5.0 μM of the porphyrinic derivative Tri-Py+-Me-PF and maintained the samples in the dark during one week of incubation after treatment. In order to assess the possible development of resistance of bacterial cells after photoinactivation, bacterial suspensions of V. fischeri and E. coli were exposed to white light (4 mW cm-2) for 25 minutes with 5.0 μM of Tri-Py+-Me-PF. After the first irradiation period, surviving colonies were reexposed to visible light using the same irradiation protocol. This procedure was repeated ten times for each strain. The results obtained in this work suggest that singlet oxygen-mediated reactions (type II mechanism) play the most important role on the photoinactivation process of the bioluminescent E. coli by Tri-Py+-Me-PF, Tetra-Py+-Me and Tri-SPy+-Me-PF derivatives. The results also show that inactivated bacteria do not recover their viability after photoinactivation and that no resistance to photodynamic therapy appears after ten generations for V. fischeri and E. coli. Although the use of scavengers represents a simple and an efficient approach to determine which pathway(s) is(are) implicated in the photodynamic inactivation process, the choice of the scavenger must take into account the chemical structure of the photosensitizer. The antimicrobial photodynamic therapy represents an adequate method to inactivate bacteria, since bacterial cells do not recover their viability after one week of incubation nor develop resistance to the photoinactivation process using Tri-Py+-Me-PF.