Identification of neuronal proteins that interact with PP1y2

Abstract

A proteína fosfatase 1 (PP1) está envolvida em múltiplos processos de grande relevância fisiológica (por ex. aprendizagem, memória e neurotransmissão) e patológica (envelhecimento, doenças neurodegenerativas). No entanto, restam ainda por estabelecer importantes interacções de relevância fisiológica, bem como a localização intracelular onde estas interacções ocorrem. Esta complexidade é originada pela existência de três isoformas da PP1, organizadas tanto espacialmente como temporalmente e que podem alterar a sua localização intracelular de forma dinâmica. Este projecto focalizou a identificação de proteínas expressas em cérebro humano que interagem com PP1γ2, através da técnica Dois Híbrido em leveduras. Através desta técnica foram obtidos 317 clones positivos, permitindo a identificação de 298 proteínas que ligam à PP1γ2 e 19 proteínas que ligam PP1γ2end, entre as quais algumas proteínas já conhecidas por interagirem com a PP1, outras nunca antes associadas com a PP1 e várias proteínas não caracterizadas. Foi feito um estudo mais detalhado para três proteínas das mais abundantes, PINK1, BRI2 e BRI3. A ligação destas proteínas com PP1 foi analisada através de várias técnicas e a sua localização subcelular e co-localização com a PP1γ e APP foi estudada por imunocitoquímica. Os resultados aqui apresentados corroboram a localização subcelular destas proteínas e a ligação já descrita entre a APP e BRI2. Permitem acrescentar que PINK1, BRI2 e BRI3 interagem com PP1γ e que não só a proteína BRI2 mas também a BRI3 interagem com APP. Estudos futuros serão necessários para compreender o papel destas interacções no sistema neuronal. Estes resultados também validam o uso do sistema YTH como um meio de estudo para melhor compreender as funções da PP1 e sua regulação em diferentes eventos celulares.

The ubiquitous protein phosphatase 1 (PP1) is involved in multiple processes of great physiological (e.g. learning, memory and neurotransmitter signaling) and pathological (aging, Alzheimer’s disease and other neurodegenerative conditions) relevance. However, many physiologically important interactions remain to be established, as well as the exact intracellular locations where these interactions take place. This complexity is provided by the existence of three PP1 isoforms that are organized both spatially and temporally, and can change their intracellular localization dynamically. This project focused on the identification of the PP1γ2 interacting proteins expressed in human brain using the Yeast Two-Hybrid system. With this technique 317 positive clones were recovered allowing the identification of 298 proteins that bind PP1γ2 and 17 proteins that bind PP1γ2end, among those are some previously known PP1 interacting proteins, other proteins never associated with PP1 before and several uncharacterized proteins. A more detailed study was carried out for three of the most abundant clones in the screen, PINK1, BRI2 e BRI3. The binding to PP1 was analyzed by several techniques and its subcellular localization and co-localization with PP1γ and APP studied by immunocytochemistry. These results corroborate the subcellular localization of this proteins and the interaction of BRI2 with APP already described. These results allow concluding that PINK1, BRI2 and BRI3 interact with PP1 and that BRI2 and BRI3 interact with APP. Further studies are needed to understand the function of the interaction of PP1 and PINK1, BRI2 and BRI3 in the neuronal system. Moreover, our results support the use of the YTH system as a means to study and understand PP1 function and regulation in different cellular events.