Diversidade e caracterização de Streptococcus de mastites de bovinos

Abstract

Streptococcus agalactiae (Streptococcus do grupo B, ou GBS), Streptococcus dysgalactiae subsp. dysgalactiae (Streptococcus do grupo C, ou GCS) e Streptococcus uberis, são agentes patogénicos frequentemente associados a mastite subclínica em bovinos. Esta doença causa avultados prejuízos económicos em explorações de bovinos leiteiros, devido a perdas na produção de leite e utilização de antimicrobianos em terapia. No entanto, a epidemiologia e a estrutura da população destes microrganismos ainda não são conhecidas em Portugal e são importantes para desenvolver programas mais adequados de terapêutica e controlo da doença. Este estudo incidiu na caracterização da resistência a antimicrobianos, clonalidade e virulência, de estirpes de campo GBS (n=32), GCS (n=17) e S. uberis (n=30) recolhidas de bovinos leiteiros em 11 explorações do Ribatejo-Oeste, Portugal, de 2002 a 2003. Cerca de 23% dos isolados das três espécies são resistentes à eritromicina e pirlimicina, ou seja, de fenótipo cMLSB (resistência constitutiva a macrólidos, lincosamidas e estreptograminas B). Isolados de GCS (12%) e S. uberis (31%) apresentam resistência à pirlimicina e susceptibilidade à eritromicina, o que sugere um novo fenótipo de susceptibilidade a macrólidos e resistência a lincosamidas e estreptograminas A (fenótipo LSA), descrito em isolados GBS de origem humana. Todos os isolados MLSB, contêm o gene de resistência a macrólidos erm(B) e não erm(A), nem mef(A), excepto um isolado GCS que é erm(A)+ erm(B)- mef (A)-. A resistência à tetraciclina foi muito elevada (60-100%) em todas as espécies. O gene tet(O) foi o mais frequentemente detectado (61%) nos isolados resistentes à tetracicilina, seguido de tet(K), (38%), tet(M), (27%) e tet(S), (16%). Em nenhum isolado foi encontrado tet(T), tet(W), tet(L) ou tet(Q). Todos os isolados apresentaram susceptibilidade à vancomicina e ao cloranfenicol. O gene de virulência speC, codificado por um genoma fágico de Streptococcus pyogenes (Streptococcus do grupo A, GAS), um agente patogénico humano, foi detectado em 29,4% dos isolados GCS, o que indica que os fagos podem contribuir para a diversidade genética e virulência de GCS de bovinos. Os padrões electroforéticos de restrição do DNA bacteriano com SmaI (PFGE) revelaram 20 tipos clonais de GBS, 29 de S. uberis e 14 de GCS (o DNA de um isolado não foi fragmentado pela SmaI). Esta análise revelou um maior grau de polimorfismo intra-espécies em S. uberis e GCS, do que em GBS. A maior parte dos clones identificados são específicos da exploração de origem. Dois isolados GCS de explorações distintas apresentam padrões de restrição idênticos. Dois clones putativos (um de serótipo V e outro de serótipo III) foram observados em isolados GBS de origem humana e bovina. Nos isolados S. uberis, testados por sequenciação de múltiplos loci (MLST), foram identificados seis novos perfis alélicos (ST), cinco dos quais com sete alelos novos, o que representa novas estruturas genómicas em S. uberis. Um dos ST pertence a um complexo clonal que inclui isolados na maioria da Nova Zelândia. Em GBS, foram encontrados dois ST relacionados (variação de um ou dois loci) com ST de origem humana.

Streptococcus agalactiae (Group B Streptococcus, GBS), Streptococcus dysgalactiae subsp. dysgalactiae (Group C Streptococcus, GCS) and Streptococcus uberis are pathogens causative of bovine mastitis, a highly prevalent and costly disease in dairy industry due to antibiotherapy and loss in milk production. However, the molecular characterization of field Streptococcus spp. isolates occurring in Portugal is still not known and is important to improve therapeutic and disease control programs. The aim of this study was to document the molecular epidemiology, antimicrobial resistance and virulence traits of field isolates of GBS (n=32), GCS (n=17) and S. uberis (n=30) collected from bovine subclinical mastitis in 11 dairy farms of the region Ribatejo-Oeste, Portugal, from 2002 to 2003. Cross-resistance to erythromycin and pirlimycin was found in all species, corresponding to the MLSB phenotype (resistance to macrolide, lincosamide and streptogramin B). Isolates of GCS and S. uberis resistant to pirlimycin and susceptible to erythromycin were detected, suggesting the new LSA phenotype (susceptibility to macrolide, resistance to lincosamide and streptogramin A) recently described in human GBS. All MLSB isolates carry the erm(B) gene and not erm(A) or mef(A), except one GCS isolate of genotype erm(A)+ erm(B)- mef(A)-. Resistance to tetracycline was found to be very high (60-100%) in all species. The tet(O) gene was the most prevalent (61%) among the tetracycline resistant isolates, followed by tet(K), (38%), tet(M), (27%) and tet(S), (16%). The following genes were not detected: tet(T), tet(W), tet(L) and tet(Q). Susceptibility to vancomycin and chloramphenicol was observed in all isolates. The phage-encoded virulence gene speC of the human pathogen Streptococcus pyogenes (Group A Streptococcus, GAS) was detected in 29,4% of GCS isolates, suggesting that prophages may also be critical contributors to the genetic diversity and virulence of bovine GCS. SmaI-macro-restriction profiles of bacterial DNA (PFGE) revealed 20 clonal types of GBS, 29 of S. uberis and 14 of GCS (one isolate was uncut by SmaI). This analysis showed a greater degree of intraspecies polymorphism for S. uberis and GCS than for GBS. Most clones were herd-specific, although two GCS isolates with identical restriction patterns were from distinct farms. Two putative clones of serotypes III and V were identified among bovine and human GBS. The S. uberis isolates analyzed by sequencing of multiple loci (MLST) were shown to have six novel allelic profiles (ST). Five of these new ST have seven novel alleles. One ST was assigned to a major clonal complex recently detected among bovine isolates from New Zealand mostly. These data represent novel genomic backgrounds of this pathogen. The bovine GBS were resolved in two ST which are closely related (one or two loci-variant) with ST of human GBS.