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http://hdl.handle.net/10773/43892
Full metadata record
DC Field | Value | Language |
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dc.contributor.advisor | Borges, Margarida Maria Coutinho Nogueira Marta | pt_PT |
dc.contributor.advisor | Macedo, Maria de Fátima Matos Almeida Henriques | pt_PT |
dc.contributor.author | Carvalho, Nuno Torres | pt_PT |
dc.date.accessioned | 2025-02-04T12:23:42Z | - |
dc.date.issued | 2024-12-09 | - |
dc.identifier.uri | http://hdl.handle.net/10773/43892 | - |
dc.description.abstract | Toxoplasma gondii (T. gondii) is an intracellular protozoan parasite from the Apicomplexa phylum. It can infect a wide range of hosts and is a highly successful parasite, infecting over 30% of the global human population. This infection can lead to the development of toxoplasmosis, which has a substantial economic and clinical burden. Its clinical relevancy is important, primarily to primo-infected pregnant women and immunocompromised individuals. While mostly asymptomatic, in risk groups, it can lead to abortions, stillbirths, neurological and organ damage, and even death. To the present day, there is no cure available for toxoplasmosis, and drug therapy aim to diminish life-threatening symptoms. As such, developing a human vaccine to prevent toxoplasmosis is essential. However, vaccine progress is slow. Thus, new candidates for vaccine formulations are being researched. Our team's previous work showed that intranasal immunisation using a T. gondii membrane protein (TGMP) extract conferred protection against acute murine infection. Dendritic cells (DCs) are crucial to cellular immune response as antigenpresenting cells, activating CD8+ T cells and CD4+ T cells and cytokine production such as interleukin 12 (IL-12). Moreover, DCs have a highly complex relationship with T. gondii. Our study aims to determine if the TGMP extract induces DC activation to be delivered in a vaccine formulation. Several batches of T. gondii tachyzoites were obtained by in vitro culture of Vero cells. Parasites were isolated through a PD-10 desalting column, and TGMP was extracted and quantified. Their protein profile was analysed using SDS-PAGE electrophoresis and silver nitrate staining. TGMP protein profiles showed intense bands with molecular weights of 17 Kilodaltons (kDa) to 19 kDa, 27 kDa to 30 kDa, and 32 kDa to 36 kDa. Afterwards, immunogenic proteins were determined by Western Blot (WB) using sera from TGMP-immunised mice. The molecular weights of the immunogenic bands detected by WB correlated with the weight ranges of the more intense bands in TGMP protein profiles. These molecular weights matched with known immunogenic proteins speculated to be in TGMP extract by liquid chromatographymass spectrometry (LCMS). There was an attempt to divide one batch of TGMP into two molecular weight fractions, one above and one below 50 kDa. This attempt was unsuccessful. As such, four TGMP batches with similar protein profiles were pooled to produce a more robust working batch. Bone marrow cells were collected from femurs and tibias of BALB/c mice and differentiated into bone marrow-derived dendritic cells (BMDC) with granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF). T. gondii sonicate (TgS) and TGMP cytotoxicity were determined by 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5 diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay. There was no cytotoxicity, and TGMP showed an increase in mitochondrial enzyme activity of BMDCs at low concentrations (0.0005μg/mL). A kinetic study where BMDC were stimulated with LPS, TGMP, or TgS and stained to determine major histocompatibility complex II (MHCII), CD80, and CD86 expression was performed. Data was collected by flow cytometry and analysed by FlowJo software. Results show an increase of MHCII expression by BMDCs at 4 and 6 hours and a decrease at 16 hours after LPS, TGMP, or TgS exposure. CD80 expression by BMDCs decreased at 4 hours but increased at 16 hours after LPS stimulation. TGMP or TgS increased CD80 expression by BMDCs at 4 and 6 hours. There was no alteration of CD86 expression by BMDCs. Experiments then focused on the same stimulants plus a recombinant T. gondii protein (rTgP) but only at 4 hours of stimulation and only testing MHCII expression by BMDCs. Polymyxin B (PolyB) was used at a concentration of 100 μg/mL to inhibit LPS contamination. Results were similar to the ones previously obtained, and rTgP also increased MHCII expression by BMDCs at 4 hours. However, PolyB induced a reversion of MHCII expression. PolyB concentration was optimised to 10 μg/mL, and the experiment was retried with additional controls. In this experiment, PolyB only reverted LPS, rTgP, and TGMP#[1,2,3,5], showing possible LPS contamination in rTgP. TGMP#[1,2,3,5] has possible protein degradation from user handling. These results show that TGMP stimulation induced MHCII expression by BMDCs not due to endotoxin contamination and is a viable candidate for a vaccine formulation. In summary, T. gondii is a more relevant parasite than what meets the eye, and developing a cure is vital. Since T. gondii has a complex relationship with DCs, they might be a good target for vaccine formulation. TGMP induces MHCII expression by BMDCs, making it a good candidate for vaccine formulation. Since it contains several known immunogenic proteins, recombinant proteins from TGMP are a promising path for vaccine development. | pt_PT |
dc.description.abstract | Toxoplasma gondii (T. gondii) é um parasita protozoário intracelular do filo Apicomplexa. Este parasita consegue infetar uma grande variedade de hospedeiros e é um parasita altamente bemsucedido, infetando mais de um terço da população humana global. A infeção por este parasita pode levar ao desenvolvimento de toxoplasmose, que causa impacto clínico e danos económicos substanciais. A sua relevância clínica advém da sua importância para mulheres, quando infetadas pela primeira vez durante a gravidez e indivíduos imunocomprometidos. Apesar de na maior parte das vezes ser assintomática, em grupos de risco, pode levar a abortos, natimortos, danos neurológicos e mesmo morte. Até hoje, ainda não existe uma cura para a toxoplasmose e os tratamentos visam em diminuir a sintomatologia. Como tal, o desenvolvimento de uma vacina para prevenir toxoplasmose em humanos é essencial. No entanto, o progresso tem sido lento. Novos candidatos para vacinas estão a ser testados. Trabalho prévio da nossa equipa mostrou que uma imunização intranasal com extrato de proteínas de membrana de T. gondii (TGMP) confere proteção contra infeção em ratinhos. Células dendríticas (DCs) são cruciais para a resposta imune celular pois são células apresentadoras de antigénio, ativam células T CD8+ e T CD4+ e produzem citosinas como a interleucina 12 (IL-12). Além disso, as DCs têm uma relação complexa com T. gondii. O objetivo deste projeto foi determinar se o extrato de TGMP induz alteração na expressão de marcadores de ativação em DCs para ser usado como uma vacina. Foram obtidos vários lotes de taquizoítos de T. gondii em cultura in vitro de células Vero. Os parasitas foram depois isolados com uma coluna de dessalinização PD-10 e o TGMP foi extraído e quantificado. Os seus perfis proteicos foram analisados por eletroforese SDS-PAGE e coloração por nitrato de prata. Os perfis proteicos de TGMP apresentam bandas intensas nos pesos moleculares de 17 Kilodaltons (kDa) a 19kDa, 27kDa a 30kDa e 32kDa a 36kDa. Depois utilizando soro de ratinhos imunizados com TGMP, detetaram-se as proteínas imunogénicas por Western Blot (WB). Os pesos moleculares destas bandas imunogénicas coincidiram com as bandas mais intensas dos perfis proteicos de TGMP. Para além disso estão de acordo com os pesos moleculares de proteínas imunogénicas conhecidas, determinadas por cromatografia líquida e espectrometria de massa (LCMS). Foi feita uma tentativa de dividir um lote de TGMP em duas frações baseadas no peso molecular, uma superior e outra inferior a 50kDa. Esta tentativa não foi bem-sucedida. Quatro lotes de TGMP com perfis proteicos semelhantes foram junto num lote maior. Células de medula óssea foram recolhidas de fémures e tíbias de ratinhos BALB/c e diferenciadas em células dendríticas derivadas de medula óssea (BMDCs) por fator de estimulação de colónia de macrófagos e granulócitos (GM-CSF). Foi determinada a citotoxicidade de sonicado de T. gondii (TgS) e TGMP por teste de brometo de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5 difeniltetrazólio (MTT). Não houve citotoxicidade e TGMP mostrou capacidade de induzir um aumento de atividade de enzimas mitocondriais em BMDCs quando em baixa concentração (0.0005μg/mL). Foi feito um estudo cinético da expressão de complexo major de histocompatibilidade II (MHCII), CD80 e CD86 por BMDCs após estimulação com LPS, TGMP ou TgS. Os resultados foram recolhidos por citometria de fluxo e analisados no FlowJo. Os resultados demonstram um aumento da expressão de MHCII por BMDCs depois de exposição com LPS, TGMP ou TgS às 4 e 6 horas e uma diminuição às 16 horas após tratamento. A expressão de CD80 por BMDCs diminui às 4 horas, mas aumentou às 16 horas após estimulação com LPS. A estimulação com TGMP ou TgS aumentou a expressão de CD80 por BMDCs às 4 e 6 horas. Não houve deteção na expressão CD86. As experiências seguintes focaram-se na expressão de MHCII em BMDCs com mesmos estímulos e com a adição de uma proteína de T. gondii recombinante (rTgP) durante apenas 4 horas de estimulação. Polimixina B (PolyB) foi utilizada a uma concentração de 100 μg/mL para inibir contaminações por LPS nos estímulos. Os resultados foram semelhantes aos anteriores e rTgP também aumentou a expressão de MHCII em BMDCs às 4 horas. No entanto, PolyB reverteu a expressão de MHCII. Por isso, a concentração de PolyB foi otimizada para 10 μg/mL e a experiência foi testada de novo com mais controlos. Nesta experiência PolyB reverteu apenas LPS, rTgP e TGMP#[1,2,3,5], mostrado potencial contaminação de LPS em rTgP. TGMP#[1,2,3,5] tem possivelmente degradação proteica devido a manipulação. Estes resultados mostram que estimulação com TGMP induz expressão de MHCII em BMDCs e como tal, é um candidato adequado para a formulação de uma vacina. Em suma, T. gondii é um parasita mais relevante do que aparenta e o desenvolvimento de uma cura é crucial. Uma vez que T. gondii tem uma relação íntima na indução de uma resposta imunoprotetora com DCs, estas constituem um bom alvo para uma vacina. O TGMP induz expressão de MHCII em BMDCs sendo assim um bom candidato para uma vacina. Uma vez que possui várias proteínas conhecidas por serem imunogénicas, proteínas recombinantes de T. gondii são uma boa opção para o desenvolvimento de uma vacina. | pt_PT |
dc.language.iso | eng | pt_PT |
dc.rights | embargoedAccess | pt_PT |
dc.rights.uri | https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ | pt_PT |
dc.subject | Toxoplasma gondii | pt_PT |
dc.subject | Dendritic cells | pt_PT |
dc.subject | Vaccine formulation | pt_PT |
dc.subject | Immunogenic proteins | pt_PT |
dc.subject | MHCII expression | pt_PT |
dc.title | Evaluation of the activation profile of dendritic cells by an extract of Toxoplasma gondii | pt_PT |
dc.title.alternative | Avaliação do perfil de ativação de células dendríticas por um extrato de Toxoplasma gondii | pt_PT |
dc.type | masterThesis | pt_PT |
thesis.degree.grantor | Universidade de Aveiro | pt_PT |
dc.date.embargo | 2026-12-09 | - |
dc.description.master | Mestrado em Microbiologia | pt_PT |
Appears in Collections: | UA - Dissertações de mestrado DBio - Dissertações de mestrado |
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