Caracterização fenotípica e genotípica de estirpes de fungos fitopatogénicos do género Phaeoacremonium

Abstract

O síndroma da esca é uma das doenças mais destrutivas da videira (Vitis vinifera L.), estando disseminado pela grande maioria dos países onde tradicionalmente se cultiva a vinha, tendo sido já identificada em diversas regiões vitivinícolas de Portugal. Pensa-se que esta doença resulta da acção de diversos fungos actuando conjuntamente ou em sucessão. De entre estes, os mais frequentes são fungos mitospóricos do género Phaeoacremonium. Neste trabalho foram analisadas 14 estirpes deste género isoladas de videiras afectadas com esca e pertencentes às espécies P. chlamydosporum, P. aleophilum, P. angustius e P. viticola. Foram realizados estudos sobre alguns aspectos fisiológicos destas estirpes, nomeadamente a produção de enzimas extracelulares e sensibilidade a fungicidas. Todas as estirpes revelaram produzir actividade de protease, lipase, amilase, celulase, xilanase e pectinase. Adicionalmente as estirpes de P. aleophilum, P. angustius e P. viticola produzem lacase e pectato liase. Todas as estirpes revelaram também maior sensibilidade aos fungicidas tiabendazol e carbendazima, do que ao zirame e ao arsenito de sódio. Neste estudo foram ainda aplicados métodos moleculares no intuito de estabelecer metodologias que permitam uma identificação/classificação rápida e fidedigna de novos isolados, bem como a tipificação e avaliação do grau de diversidade genómica destes. Foram também aplicados métodos moleculares na tentativa de contribuir de algum modo para o esclarecimento da posição taxonómica deste género. Uma abordagem à separação do cariótipo destes organismos por electroforese em campo pulsado (PFGE) demonstrou que o cariótipo dos organismos classificados como P. chlamydosporum, é substancialmente diferente do cariótipo dos organismos pertencentes às restantes espécies. Métodos moleculares direccionados para regiões conservadas no genoma parecem ser os mais adequados para uma identificação ao nível da espécie. Assim, a análise de ribotipagem, utilizando a ER BamHI, e a amplificação da região ITS2 por PCR, seguida de digestão com a ER NciI (ITS-ARDRA) revelaram capacidade para aplicação na identificação de novos isolados. Os métodos de rep-PCR e MSP-PCR permitem a tipagem e avaliação do grau de diversidade genómica de isolados/estirpes. Os resultados da caracterização genotípica permitem verificar que a espécie P. chlamydosporum é muito diferente das espécies P. aleophilum, P. angustius e P. viticola, o que está de acordo com a sua reclassificação no novo género Phaeomoniella. De igual modo, e tal como descrito, os resultados obtidos indicam também que as espécies P. aleophilum e P. angustius são idênticas. Foi ainda clonado e sequenciado um fragmento de sintetase de quitina de cada uma das estirpes de P. chlamydosporum. Nas restantes espécies não foi possível detectar fragmentos homólogos a este. A análise da sequência nucleotídica e de a.a. deduzida revelou tratar-se de uma sintetase de quitina de classe I. A análise filogenética desta sequência mostra que P. chlamydosporum forma um grupo à parte das restantes espécies analisadas. De todas estas, P. chlamydosporum está aparentemente mais próxima de espécies de ascomicetos, tais como A. niger, A. nidulans, B. dermatitidis e H. capsulatum.

Esca syndrome is one of the most destructive diseases of grapevine (Vitis vinifera L.). This disease is widespread in the vast majority of countries where vines are grown, and was already identified in several Portuguese regions. Apparently it results from the action of several fungi acting in combination or forming a succession of microorganisms. Among these, the most frequent are mitosporic fungi of the genus Phaeoacremonium. In this work, 14 strains of this genus isolated from esca affected grapevines and belonging to the species P. chlamydosporum, P. aleophilum, P. angustius and P. viticola were studied. Studies on some physiological aspects were directed to the production of extracellular enzymes and sensitivity to fungicides. All strains exhibited lipase, amylase, cellulase, xylanase and pectinase activities. Additionally strains from P. aleophilum, P. angustius and P. viticola produced laccase and pectate lyase. All strains also revealed greater sensitivity to fungicides thiabendazol and carbendazim than to ziram or sodium arsenite. Molecular methods were used in this work aiming to establish methodologies that allow an easier and more reliable identification/classification of new isolates, and also the typing and evaluation of genetic diversity of these isolates. We also used molecular methods that may help shedding some light into the taxonomy of these fungi. An approach to the separation of the karyotype of these organisms using pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) was made. It was possible to show that the electrophoretic karyotyope of P. chlamydosporum is considerably different from the electrophoretic karyotyope of the remaining species of the genus. Molecular methods directed to conserved regions in the genome seem to be the most adequate to identification at species level. So, ribotyping using BamHI and the PCR amplification of ITS2 region followed by NciI digestion of amplified products (ITS -ARDRA) appear as good methods to be applied in the identification of new isolates. rep-PCR and MSP-PCR allow the typing and evaluation of genetic diversity of isolates/strains. The results from the genetic characterisation allowed us to verify that P. chlamydosporum is very different from P. aleophilum, P. angustius and P. viticola. This is in agreement with it’s reclassification in the new genus Phaeomoniella. In the same way and as described, the results obtained show that the species P. aleophilum and P. angustius are identical. A chitin synthase DNA fragment was cloned and sequenced for all P. chlamydosporum strains. In all other species it was not possible to detect homologues of this fragment. The nucleotide and deduced amino acid sequence analysis revealed that this fragment belonged to a class I chitin synthase. The phylogenetic analysis based on this sequence revealed that P. chlamydosporum forms a group distinct from the other species analysed. Nevertheless, among these P. chlamydosporum seems more closely related to ascomycetes like A. niger, A. nidulans, B. dermatitidis and H. capsulatum.