Characterization of a C-terminal domain from eag potassium channel

Abstract

Domínios que ligam nucleotideos cíclicos (CNBD) regulam muitas vias de sinalização em células procarióticas e eucarióticas. Os ligandos AMP cíclico ou GMP cíclico ligam-se a estes domínios e induzem uma alteração conformacional que é propagada ao domínio efector, como uma cinase ou um canal iónico. Os canais de potássio da família ether-a-go-go (EAG) estão envolvidos em muitos processos fisiológicos que incluem repolarização cardíaca e neuronal, proliferação tumoral e secreção de hormonas. Estes canais são tetraméricos e cada subunidade inclui seis hélices transmembranares e dominios citoplasmáticos em N- e C-terminal. O domínio em C-terminal tem homologia com domínios que ligam nucleotídeos cíclicos mas foi demonstrado que os canais EAG não são afectados por nucleotídeos e o domínio não liga nucleotideos. O objectivo deste projecto foi resolver a estrutura de um domínio C-terminal de um canal EAG por cristalografia de raios-X e compreender o seu papel funcional. Determinei a estrutura de um destes domínios à resolução de 2,2 Å; a estrutura tem a topologia de um CNBD mas a cavidade de ligação apresenta várias diferenças relativamente à de domínios que ligam nucleotideos cíclicos. Mais ainda, os canais EAG são inibidos por calmodulina e há dois locais de ligação de calmodulina a seguir ao CNBD. A estrutura mostrou que um destes locais se encontra sobreposto com uma região do domínio levantando a possibilidade da calmodulina regular o canal através da alteração conformacional do domínio C-terminal dos canais EAG. Esta possibilidade começou a ser explorada com recurso a ensaios de cross-linking químico e espectroscopia de fluorescência.

Cyclic nucleotide binding domains (CNBD) are regulatory domains that participate in many signaling pathways in prokaryotic and eukaryotic cells. The ligand cAMP or cGMP binds these domains and induces a conformational change that is propagated to an effector domain, like a kinase or an ion channel. The ether-a-go-go (EAG) potassium channel family is involved in important physiological roles that include cardiac and neuronal repolarization, tumor proliferation and hormone secretion. These channels are tetramers, where each subunit includes six transmembrane helices and N- and C-terminal cytoplasmic domains. The C-terminal domain has strong homology to CNBDs but it has been demonstrated that EAG channels are not affected by cyclic nucleotides and that the domain does not bind nucleotides. The ultimate goal of this project was to solve the structure of an EAG family C-terminal domain by X-ray crystallography and to understand its functional role. I have determined the structure of one of these domains at 2.2 Å; the structure has the canonical CNBD fold but it shows a ligand pocket that has several differences relative to a cyclic nucleotide binding site. Furthermore, EAG currents are inhibited by calmodulin binding and there are two calmodulin binding sites C-terminal to the CNBD. The structure reveals that one of these sites overlaps with a region of the domain raising the possibility that calmodulin affects channel function by changing the EAG C-terminal domain conformation. I have conducted preliminary tests on this hypothesis by using biochemical cross-linking experiments and fluorescence spectroscopy.