Design of novel protein fibrils-based biomaterials for the regeneration of injured myocardium tissue

Abstract

Cardiovascular diseases, namely myocardial infarction, are the main cause of death in the modern world. Currently, the only efficient form of treatment available is heart transplantation. Therefore, it is urgent to develop alternative and efficient therapies for the treatment of myocardial infarction. For example, tissue engineering that combines cells with biomaterials has the therapeutic purpose of regenerating a damaged tissue, inducing cell growth and differentiation, while biomaterials are slowly bioresorbed. The results already obtained in this domain demonstrate the potential of this strategy in myocardial regeneration, however the development of biomaterials with adequate properties is still one of the main limitations. Implantable patches and injectable hydrogels are the most explored biomaterials for myocardial regeneration applications. In particular, implantable biopolymeric patches have enormous potential for regenerating myocardial infarcted tissues, however, most of them generally lack adequate mechanical performance, stability in aqueous media, and important functionalities, such as antioxidant activity. Likewise, injectable biopolymeric hydrogels are promising biomaterials for this application. In addition to being biocompatible, they adapt perfectly to the surrounding tissue. However, they present the same limitations as implantable biopolymeric patches. To circumvent the listed disadvantages, composite biomaterials can be developed by incorporating suitable functional reinforcement materials such as nanofibrils (NFs) of biological origin. For example, protein NFs are biocompatible nanostructures with excellent mechanical performance, water insolubility and, in some cases, antioxidant activity, which have already been exploited to manufacture biomaterials for different biomedical applications. In this context, the objective of this thesis consisted in the production and characterization of lysozyme NFs (LNFs), and their combination with other biopolymers to produce implantable nanostructured patches and injectable nanocomposite hydrogels, following different strategies, to mimic the structure and microenvironments found in a healthy extracellular matrix. Finally, the resulting biomaterials were characterized, considering the desired properties and functionalities for myocardial regeneration applications. In the first study, LNFs were used to improve the properties and functionalities of electrospun gelatin cardiac patches. The addition of LNFs (5% and 10% (w/w), relatively to gelatin content), to electrospun patches improved their mechanical properties in the wet state (Young's modulus from 3 MPa (no added fibrils), to 6 MPa for the addition of 5% or 10% (w/w) of nanofibrils), being in accordance with myocardial contractility requirements. Furthermore, an increase in antioxidant activity from 60% to 80% of 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) radical scavenging was observed in 2 hours, when adding only 5% (w/w) of LNFs, and the rate of bioresorbability was reduced to 30-35 days, in comparison with the 45 days observed for the gelatin-only patches, maintaining its morphology and biocompatibility in relation to rat cardiomyoblasts and human dermal fibroblasts. Finally, a hydrophobic drug (curcumin) was loaded into the patches and its release was investigated, being partially burst released (15% in the first day) and maintained at a constant concentration for 21 days. In the next study, LNFs were combined with periodate-oxidized cellulose nanofibers (OxNFC, 1:1 (w/w)), to prepare an implantable fibrillar patch. Comparing with the patches contain only cellulose nanofibers (NFC), OxNFC, or NFC:LNFs, the patch of OxNFC:LNFs, showed better mechanical properties in the wet state (Young modulus of 60 MPa), antioxidant activity (70% free DPPH radical scavenging in 24 h), and superior bioresorbability rates (80% in 91 days). These improvements were achieved while preserving the patch morphology and its biocompatibility towards rat cardiomyoblast cells. Additionally, these patches can function as efficient vehicles for delivering siRNA-loaded nanoparticles into damaged tissue. In the final study, LNFs were used as nanoreactors to produce in situ gold nanoparticles (AuNPs) and the hybrid NFs, containing AuNPs (AuNPs@LNFs), were incorporated into injectable hydrogels of gelatin and hyaluronic acid (HA), in proportions of 5% and 10% (w/w), of total biopolymeric content. The obtained nanocomposite hydrogels showed improved rheological properties, mechanical resilience to cyclic compression of 30%, electrical conductivity (3.5-5 mS.cm-1 respectively for the contents of 5% and 10% (w/w) of hybrid nanofibrils), and antioxidant activity (70% DPPH radical scavenging in 24 hours). The swelling and bioresorbability rates of these hydrogels favorably adapted in lower pH environments, which correspond to those of inflamed tissues. These improvements were observed while maintaining other important properties, such as injectability, biocompatibility and the ability to deliver a model hydrophilic drug (CHIR 99021 trihydrochloride). In addition, the presence of AuNPs also allowed the monitoring of hydrogels by means of computed tomography. Overall, the results of these studies demonstrate that LNFs have great potential as functional reinforcement nanostructures for the fabrication of different biomaterials, namely implantable biopolymeric patches and injectable hydrogels, for application in the regeneration of damaged myocardial tissue.

As doenças cardiovasculares, nomeadamente o enfarte do miocárdio, são a principal causa de morte no mundo moderno. Atualmente, a única forma eficiente de tratamento disponível é o transplante cardíaco. Portanto, é urgente desenvolver terapias alternativas e eficientes para o tratamento do enfarte do miocárdio. Por exemplo, a engenharia de tecidos que combina células com biomateriais tem o propósito terapêutico de regenerar o tecido danificado, induzindo o crescimento e a diferenciação celular, enquanto os biomateriais são lentamente bioabsorbidos. Os resultados já obtidos neste domínio demonstram as potencialidades desta estratégia na regeneração do miocárdio, porém o desenvolvimento de biomateriais com propriedades adequadas ainda é uma das principais limitações. Os emplastros implantáveis e os hidrogéis injetáveis são os biomateriais mais explorados para aplicação na regeneração do miocárdio. Nomeadamente, os emplastros biopoliméricos implantáveis apresentam um enorme potencial para a regeneração de tecidos do miocárdio enfartado, no entanto, a maioria deles geralmente não possui um desempenho mecânico adequado, estabilidade em solução aquosa, e funcionalidades importantes, como por exemplo, atividade antioxidante. Da mesma forma, os hidrogéis biopoliméricos injetáveis são biomateriais promissores para esta aplicação. Além de serem igualmente biocompatíveis, ajustam-se perfeitamente ao tecido circundante. Contudo, também apresentam limitações semelhantes aos emplastros biopoliméricos. Para contornar as desvantagens elencadas, podem-se desenvolver biomateriais compósitos por incorporação de materiais de reforço com diversas funcionalidades, como as nanofibrilas de origem biológica. Por exemplo, as nanofibrilas de proteína são nanoestruturas biocompatíveis com excelente desempenho mecânico, insolubilidade em água, e em alguns casos atividade antioxidante, que já foram exploradas para fabricar biomateriais para diferentes aplicações biomédicas. Neste contexto, o objetivo desta tese consistiu na produção e caracterização de nanofibrilas de lisozima, e a sua combinação com outros biopolímeros para produzir emplastros nanoestruturados implantáveis e hidrogéis nanocompósitos injetáveis, seguindo diferentes estratégias, para mimetizar a estrutura e microambientes encontrados numa matriz extracelular saudável. Por fim, os biomateriais resultantes foram caracterizados, considerando as propriedades e funcionalidades desejadas para aplicação na regeneração do miocárdio. No primeiro estudo, as nanofibrilas de lisozima foram utilizadas para melhorar as propriedades e funcionalidades de emplastros cardíacos electrofiados de gelatina. A adição das nanofibrilas de lisozima (5% e 10% (m/m), relativamente à quantidade de gelatina) aos emplastros electrofiados melhorou as suas propriedades mecânicas no estado húmido (módulo de Young de 3 MPa (emplastro sem fibrilas), para 6 MPa para a adição de 5% ou 10% (m/m) de nanofibrilas), estando de acordo com os requisitos de contratilidade do miocárdio. Além disso, observou-se um incremento da atividade antioxidante, de 60% para 80%, de eliminação do radical 1,1-difenil-2-picrilhidrazil (DPPH) em 2 horas, ao adicionar-se apenas 5% (m/m) de nanofibrilas de lisozima, e a taxa de bioabsorção foi reduzida para 30-35 dias, em comparação com os 45 dias observados para os emplastros contendo apenas gelatina, mantendo-se sua morfologia e biocompatibilidade em relação a cardiomioblastos de rato e fibroblastos dérmicos humanos. Por fim, um fármaco hidrofóbico (curcumina), foi incorporado nos emplastros e a sua libertação foi investigada, sendo libertada parcialmente (15% no primeiro dia), e mantida uma concentração constante por 21 dias. No estudo seguinte, as nanofibrilas de lisozima foram combinadas com nanofibras de celulose oxidadas com periodato (1:1 (m/m)), de modo a preparar um emplastro fibrilar implantável. Comparando com emplastros contendo apenas nanofibras de celulose, nanofibras de celulose oxidadas, ou nanofibras de celulose com nanofibrilas de lisozima, o emplastro de nanofibrilas de lisozima e nanofibras de celulose oxidadas, apresentou propriedades mecânicas no estado húmido (módulo de Young de 60 MPa), atividade antioxidante (70% de eliminação do radical DPPH em 24 h), e taxa de bioabsorção (80% em 91 dias) superiores. Estas melhorias foram alcançadas preservando a morfologia do emplastro e a sua biocompatibilidade para com células de cardiomioblastos de rato. Adicionalmente, estes emplastros podem funcionar como veículos eficientes para administrar nanopartículas carregadas com siRNA no tecido danificado. No último estudo, as nanofibrilas de lisozima foram usadas como nanorreatores para produzir nanopartículas de ouro in situ, e as nanofibrilas híbridas, contendo nanopartículas de ouro, foram incorporadas em hidrogéis injetáveis de gelatina e ácido hialurónico em proporções de 5% e 10% (m/m), relativamente à quantidade total de biopolímeros. Os hidrogéis nanocompósitos obtidos apresentaram propriedades reológicas melhoradas, resiliência mecânica para uma compressão cíclica de 30%, condutividade elétrica (3,5 e 5 mS.cm-1, respetivamente para hidrogéis contendo 5% e 10% (m/m) de nanofibrilas híbridas), e atividade antioxidante (70% de eliminação do radical DPPH em 24 horas). As taxas de intumescência e bioabsorção destes hidrogéis adaptam-se favoravelmente em ambientes de pH mais baixos, que correspondem aos dos tecidos inflamados. Estas melhorias foram observadas mantendo outras propriedades importantes, como a injectabilidade, biocompatibilidade e a capacidade de libertar um medicamento hidrofílico modelo (CHIR 99021 tri-hidroclorídrico). Adicionalmente, a presença de nanopartículas de ouro permitiu também a monitorização dos hidrogéis por tomografia computadorizada. No geral, os resultados destes estudos demonstram que as nanofibrilas de lisozima têm um enorme potencial como nanoestruturas de reforços funcionais para a fabricação de diferentes biomateriais, nomeadamente emplastros biopoliméricos implantáveis e hidrogéis injetáveis, para aplicação na regeneração do tecido do miocárdio danificado.