Estudo da estabilidade, actividade e cinética enzimática da lacase em líquidos iónicos

Abstract

Este trabalho teve como objectivo estudar a actividade, a estabilidade e a cinética enzimática da lacase, produzida através do fungo Trametes versicolor, na presença de três líquidos iónicos (LIs) o 3-dimetilimidazólio metilsulfato ([mmim][MeSO4]), o 1-etil-3-metilimidazólio metilsulfato ([emim][MeSO4]) e o 1-butil-3-metilimidazólio metilsulfato ([bmim][MeSO4]). Os estudos preliminares realizados com o [emim][MeSO4] revelaram que este inibe completa e instantaneamente a lacase pelo que nos estudos seguintes se prosseguiu apenas com os outros dois líquidos iónicos. A primeira parte do trabalho consistiu no estudo de inactivação térmica e na estabilidade da lacase na presença dos LIs. O estudo foi realizado variando a temperatura (25, 35, 45 e 55 ºC), o pH (5.0, 7.0 e 9.0) e a concentração de LI (10, 25 e 50% VLI/VTampão). Foi possível verificar que a inactivação térmica segue uma cinética de 1ª ordem. As constantes cinéticas (k) sobem desde valores muito próximos de zero até valores na ordem dos 8 dias-1, para uma temperatura de 55 ºC e pH 9.0. A energia de activação aumentou com o aumento do pH na presença de [mmim][MeSO4], mas praticamente não variou com o [bmim][MeSO4]. Com relação à estabilidade enzimática, verificou-se que a lacase é mais estável a uma temperatura de 25 ºC, a pH 5.0 e com uma concentração de LI de 10% VLI/VTampão. A segunda parte do trabalho consistiu no estudo da cinética de reacção de oxidação do ABTS (Ácido 2,2’-azino-bis(3-etilbenzotiazolina-6-sulfónico)) pela lacase a 25 ºC e a pH 7.0, variando-se a concentração de substrato. Os resultados experimentais foram modelados pela cinética de Michaelis-Menten e os parâmetros cinéticos foram calculados sendo a velocidade máxima da reacção de 1,94 mM/min e a constante de Michaelis-Menten de 1,36×10-3 mM com um erro relativo associado de 1,30%. Este estudo foi realizado ainda na presença de diferentes concentrações de LI (15, 25 e 35% VLI/VTampão). Para concentrações de LI de 15 e 25% VLI/VTampão não houve alterações cinéticas na reacção, pelo que se conclui que não ocorre qualquer tipo de inibição da lacase a estas concentrações de LI. No entanto verificou-se que ocorre uma grande activação enzimática da lacase, em cerca de 40% da velocidade máxima da reacção, na presença de 35% VLI/VTampão de qualquer dos dois líquidos iónicos.

This work aimed to study the activity, stability and enzyme kinetics of laccase produced by the fungus Trametes versicolor in the presence of three ionic liquids (ILs) 1,3-dimethylimidazolium methylsulfate ([mmim] [MeSO4]), 1-ethyl-3-methylimidazolium methylsulfate ([emim][MeSO4]) and 1-butyl-3-methylimidazolium methylsulfate ([bmim][MeSO4]). Preliminary studies performed with [emim][MeSO4] showed that it inhibited completely and instantly the lacase. The following studies were performed only with the other two ionic liquids. The first part of this work was the study of thermal inactivation and stability of laccase in the presence of ILs. The study was made with different temperatures (25, 35, 45 and 55 °C), different pHs (5.0, 7.0 and 9.0) and different concentrations of IL (10, 25 and 50% VIL/VBuffer). It was verified that thermal inactivation follows 1st order kinetics. The kinetic constant (k) rises from values closed to zero until 8 days-1 for temperature of 55°C and pH 9.0. The activation energy increased with increasing pH in the presence of [mmim] [MeSO4], but there was no variation with [bmim][MeSO4]. Concerning the stability of the enzyme, it was found that the laccase is more stable at a temperature of 25 °C, pH 5.0 and with a concentration of 10% VIL/VBuffer. The second part of this work was to study the reaction kinetics of the oxidation of ABTS (2,2'-azin-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)) by laccase at 25°C and pH 7.0, for several substrate concentrations. The experimental results were modelled by the Michaelis-Menten enzymatic kinetics. Kinetic parameters were calculated and the maximum reaction rate was 1.94 mM/min and the Michaelis-Menten constant was 1.36×10-3 mM with an average relative deviation of 1.30%. This reaction was also studied in presence of different concentrations of IL (15, 25 and 35% VIL/VBuffer) in order to evaluate IL effect on lacase kinetics. For concentrations of IL 15 and 25% VIL/VBuffer no changes in reaction kinetics have been observed allowing to conclude that there is no inhibition of laccase at these IL concentrations. However it was found that a powerful laccase enzymatic activation has occurred, nearly 40% of the maximum reaction rate, in the presence of 35% VIL/VBuffer of any of the ionic liquids.