Wild mammals in Portugal: gut microbiota as a source of pathogenic bacteria and antibacterial resistance

Abstract

As the human population increases and expands, the natural habitats become more fragmented, and wildlife comes into contact with humans and their livestock, increasing the possibility of transmission of pathogens between populations. Antimicrobial resistance (AMR) is a major problem that threats global health security. Several studies investigated AMR in wildlife microbiota, and it has been suggested that the proximity to human populations and their activities impacts wildlife resistome. This raises the possibility of AMR bacteria to spread through the food chain or other routes and disseminate into the environment. The transmission of AMR is a complex, dynamic and multi-layered process, that involves humans, animals, and the environment, being an One Health issue. Little is known about the abundance and diversity of ARGs and MGEs in wildlife. The aim of the present thesis was to characterize the AMR and the shiga toxinproducing Escherichia coli (STEC) linked to the faecal microbiota of four wild mammal species in Portugal: wild boar (Sus scrofa), red deer (Cervus elaphus), Eurasian otter (Lutra lutra) and red fox (Vulpes vulpes). Faecal samples from wild boar (n=56), red deer (n=101), Eurasian otter (n=92) and red fox (n=37) were collected from Montesinho Natural Park, Lousã Mountain, Tapada Nacional de Mafra, Baixo Vouga Lagunar, and Freita, Arada and Montemuro Mountains. The general levels of AMR in two bacterial indicators, E. coli and Enterococcus spp., were determined by antibiotic susceptibility testing, and the faecal resistome of each mammal species was characterized regarding diversity and abundance using qPCR arrays. In general, the E. coli isolates were mainly resistant to β-lactams, aminoglycosides and tetracycline, and had a non-wildtype phenotype mainly for quinolones, β- lactams and tetracycline. The Enterococcus spp. isolates were mostly resistant to glycylcycline, streptogramin, and tetracycline classes, having a non-wildtype phenotype mainly associated with aminoglycoside, tetracycline and macrolide classes. Resistant and multidrug-resistant strains were isolated from the four wild mammal species. In general, the most frequently detected ARGs confer resistance to aminoglycosides, tetracyclines, MLSBs and β-lactams. The most abundant ARGs types differ between mammal species, but tetracycline ARGs were on the top 3 most abundant groups for all the species, and aminoglycoside ARGs were on the top 3 for three animal species (except for otter). High-risk ARGs that may pose a threat to human health were found in the four wildlife species, with the highest relative abundance in red fox. Regarding STEC, the prevalence was of 17%, with strains recovered from the four species, mainly deer. This thesis reports for the first time the occurrence of STEC in Eurasian otter. The phylogenetic relationship of the STEC isolates was assessed by PFGE, and 20 representative isolates were selected for whole genome sequencing. The most abundant serotype identified does not cause disease in humans, but the other four serotypes have been associated with human infections in the EU, highlighting their pathogenetic potential. In addition to Shiga toxin, all genomes encode, at least, 10 additional virulence factors. Also, some wildlife STEC have close evolutionary relationships with human-derived STEC. The results obtained throughout this thesis highlight the relevance of the different wild species as reservoirs of AMR and potential pathogenic STEC. Surveillance of AMR and the development of monitoring programs for commensal and zoonotic bacteria are strategic priorities to limit AMR transmission.

Com o aumento e expansão da população humana, os habitats naturais tornam-se cada vez mais fragmentados, passando a existir um maior contacto dos seres humanos e do seu gado com a vida selvagem, aumentando a possibilidade de transmissão de agentes patogénicos entre as diferentes populações (humana e animal). A resistência antimicrobiana (AMR) é um problema mundial que ameaça a saúde e a segurança global. Vários estudos têm investigado a resistência antimicrobiana na microbiota da vida selvagem, e tem sido sugerido que a proximidade das populações humanas, bem como as suas atividades, tem impacto no resistoma da vida selvagem. Este facto levanta a possibilidade de bactérias resistentes a antimicrobianos se propagarem através da cadeia alimentar ou outras vias, disseminando-se no ambiente. A transmissão de AMR é um processo complexo, dinâmico e multifacetado, que envolve os seres humanos, os animais e o ambiente, e é um problema de Saúde Única (One Health). Contudo, ainda pouco se sabe sobre a abundância e diversidade de ARGs e MGEs na vida selvagem. O objetivo da presente tese foi caracterizar a AMR e Escherichia coli produtora de toxina Shiga (STEC) associada à microbiota fecal de quatro espécies de mamíferos selvagens em Portugal: o javali (Sus scrofa), o veado (Cervus elaphus), a lontra euro-asiática (Lutra lutra), e a raposa-vermelha (Vulpes vulpes). Para tal, foram recolhidas amostras de fezes de javali (n=56), veado (n=101), lontra euroasiática (n=92) e raposa-vermelha (n=37), no Parque Natural de Montesinho, Serra da Lousã, Tapada Nacional de Mafra, Baixo Vouga Lagunar, e Serras da Freita, Arada e Montemuro. Os níveis gerais de AMR nos dois indicadores bacterianos, E. coli e Enterococcus spp., foram determinados por testes de suscetibilidade a antibióticos, e a resistência fecal de cada uma das espécies de mamíferos foi caracterizada relativamente à diversidade e abundância, usando matrizes (arrays) de qPCR. De uma forma geral, os isolados de E. coli eram principalmente resistentes aos β-lactâmicos, aminoglicosídeos e tetraciclina, e tinham um fenótipo do tipo não-selvagem, principalmente às quinolonas, aos β- lactâminos e à tetraciclina. Os isolados de Enterococcus spp. exibiam resistência, principalmente, às classes: glicilciclina, estreptogramina e tetraciclina, tendo um fenótipo do tipo não-selvagem associado às classes dos aminoglicosídeos, da tetraciclina e dos macrólidos. Foram isoladas estirpes resistentes e multirresistentes das quatro espécies de mamíferos selvagens. De uma forma geral, os ARGs mais frequentemente detetados conferem resistência aos aminoglicosídeos, às tetraciclinas, aos MLSBs e aos β-lactâmicos. Os tipos de ARGs mais abundantes diferem entre as espécies de mamíferos, sendo que os ARGs de tetraciclina fazem parte dos três grupos mais abundantes para todas as espécies, e os ARGs de aminoglicosídeos também fazem parte dos três grupos mais abundantes, com exceção da lontra. Os ARGs de risco elevado, que podem representar uma ameaça para a saúde humana, foram encontrados nas quatro espécies selvagens, com uma maior abundância relativa na raposa vermelha. Relativamente às STEC, a sua prevalência foi de 17%, tendo sido isoladas das quatro espécies, maioritariamente de veados. Esta tese reporta pela primeira vez a ocorrência de STEC na lontra euro-asiática. A relação filogenética dos isolados STEC foi avaliada por PFGE, e destes, os 20 mais representativos foram selecionados para sequenciação do seu genoma completo. O serotipo mais abundante não é reportado como sendo causador de doença em humanos. Os outros quatro serotipos foram associados a infeções humanas na EU, o que mostra o seu potencial patogénico. Para além da toxina Shiga, todos os genomas codificam para, pelo menos, outros 10 fatores de virulência. Algumas das STEC destes animais selvagens têm relações evolutivas próximas com STEC de origem humana. Os resultados obtidos ao longo desta tese realçam a relevância das quatro espécies selvagens como reservatórios de AMR e de STEC potencialmente patogénica. Assim, a vigilância da AMR e o desenvolvimento de programas de monitorização de bactérias comensais e zoonóticas são prioridades estratégicas para limitar a transmissão da AMR.