Modulação purinérgica da transmissão noradrenérgica no córtex cerebral

Abstract

No córtex cerebral de rato, a libertação de noradrenalina (NA) pode ser desencadeada por activação de neurónios que se projectam a partir do locus coeruleus ou então por activação local dos receptores NMDA do glutamato. Ambos os processos são regulados por nucleótidos como o ATP, através da activação de receptores P2Y, embora os subtipos de receptores P2Y envolvidos ainda não tenham sido identificados. O ATP desempenha igualmente um papel importante na captação de NA pelos astrócitos e na comunicação neurónio-astrócito em sinapses noradrenérgicas e uma desregulação na transmissão noradrenérgica pode contribuir para várias patologias como as perturbações do humor (depressão, doença bipolar, mania, ansiedade) e as doenças neurodegenerativas. O objectivo deste estudo consistiu na caracterização dos receptores P2Y envolvidos na regulação da transmissão noradrenérgica no córtex cerebral de Rato, através do estudo do efeito de vários agonistas purinérgicos e da sua interacção com antagonistas selectivos, na modulação da libertação de NA induzida por estimulação eléctrica (100 pulsos a 5 Hz) em fatias de córtex, e na captação de NA em culturas primárias de astrócitos. Os nucleótidos ATP, ADP, ADPβS, UTP, UDP inibiram a libertação de NA até 58% com a seguinte ordem de potência: ADP ≥ ATP> ADPβS > UTP≥ UDP. O efeito inibitório do ADP (0,3 mM) e do ADPβS (0,3 mM) foram ambos bloqueados pelos antagonistas selectivos dos receptores A1 e P2Y1, DPCPX (0,1 μM) e MRS 2500 (1 M), respectivamente. Os efeitos inibitórios do UTP (1 mM) e UDP (1 mM) foram ambos antagonizados pelo MRS 2578 (1 M) que é um antagonista selectivo para os receptores P2Y6. Ao contrário do ADP (0,3 mM), o efeito do ADPβS (0,3 mM) não foi modificado pela desaminase da adenosina (ADA, 2U/ml), excluindo um papel da adenosina nos efeitos antagonizados pelo DPCPX (0,1 μM). No entanto o efeito do ADPβS foi abolido pela combinação de DPCPX (0,1 μM) e MRS 2500 (1 μM), sugerindo parte do efeito inibitório deste agonista na libertação de NA poderá ser mediada por heterodímeros A1/P2Y1. Nas culturas de astrócitos, os agonistas ADP S (0,1 mM), UDP (1 mM) e CGS 21680 (0,1 μM) aumentaram captação de NA até 117 %. O efeito do ADPβS (0,1 mM) foi antagonizado pelo MRS 2500 (0.1 μM) e pelo antagonista selectivo dos receptores P2Y12 AR-C66096 (10 μM). O efeito do UDP (1 mM) foi atenuado pelo MRS2578 (1 μM) e o efeito facilitatório do CGS 21680 (0,1 μM) na captação de NA foi atenuado pelo antagonista selectivo dos receptores A2A SCH58261 (30 nM). Em conclusão, os nucleótidos inibem a libertação de NA por activação de receptores P2Y1, P2Y6, A1 e possivelmente heterodímeros A1/P2Y1. Também aumentam a captação de NA pelos astrócitos através da activação de receptores P2Y1, P2Y12,P2Y6 e A2A, em ambos os casos conduzindo a uma inibição da transmissão noradrenérgica no córtex cerebral.

In the rat cerebral cortex, release of noradrenaline (NE) can be triggered by activation of neurons projecting from locus coeruleus and by locally released glutamate through activation of NMDA receptors. Both mechanisms are regulated by nucleotides such as ATP, which acts through activation of P2Y receptors; however the subtypes involved have not yet been identified. ATP plays an equally important role in the uptake of NE by astrocytes and in the neuron-astrocyte communication at noradrenergic synapses, with a deregulation of noradrenergic transmission being associated to the pathogenesis of several mood disorders and neurodegenerative diseases. The aim of this thesis was to identify, in the rat barin cortex, the P2Y receptors involved in the regulation of noradrenergic transmission by testing the effect of several purinergic agonists and its interaction with selective antagonists in NE release, evoked by electrical field stimulation (100 pulses at 5 Hz) of cortical brain slices, and in NE uptake by primary cultures of cortical astrocytes. The nucleotides ATP, ADP, ADPβS, UTP and UDP caused an inhibition of NE release up to 58% with the following order of potency: ADP≥ATP> ADPβS>UTP≥UDP. The inhibitory effect of ADP (0,3 mM) and ADPβS (0,3 mM) were both attenuated by the selective antagonists of A1 and P2Y1 receptors, DPCPX (0,1 μM) and MRS 2500 (1 M), respectively. The inhibitory effects of UTP (1 mM) and UDP (1 mM) were antagonized by MRS 2578 (1 M) which is a selective P2Y6 receptor antagonist. Unlike the effect of ADP (0,3 mM), the effect of ADPβS (0,3 mM) was not changed by the adenosine deaminase, excluding the participation of adenosina on the effects antagonized by DPCPX (0,1 μM). However, the effect of ADPβS was abolished by DPCPX (0,1 μM) in combination with MRS 2500 (1 μM), suggesting that a component of the inhibitory effect of this agonist in the NA release could be mediated by A1/P2Y1heterodímers. In primary astrocyte cultures, the agonists ADP S (0,1 mM), UDP (1 mM) and CGS 21680 (0,1 μM) all increased NE uptake up to 117 %. The effect of ADPβS (0,1 mM) was almost abolished by MRS 2500 (0.1 μM) and was also attenuated by the P2Y12 antagonist AR-C66096 (10 μM) whereas the effect of UDP (1 mM) was attenuated by MRS 2578 (1 μM) and the facilitatory effect of CGS 21680 (0,1 μM) on NE uptake was reduced by the selective antagonist of A2A receptors SCH 58261 (30 nM). In conclusion, the nucleotides tested inhibited NE release evoked by electrical stimulation through activation of P2Y1, P2Y6, A1 receptors and eventually A1/P2Y1 heterodímers. Additionally, they increased NA uptake by astrocytes upon activation of P2Y1, P2Y12 ,P2Y6 e A2A receptors, in both cases leading to an inhibition of the noradrenergic transmission in the rat brain cortex.