Controlo microbiológico de culturas mistas para a produção de PHA

Abstract

O presente trabalho vem em resposta à necessidade de redução de resíduos dispensados para o meio ambiente, nomeadamente os plásticos, assim como a utilização de recursos renováveis em processos industriais. Neste contexto, os polímeros têm-se vindo a tornar um problema grave devido à sua elevada resistência à biodegradação e consequente acumulação no meio, pelo que os biopolímeros representam um potencial para a substituição sustentável de termoplásticos derivados de combustíveis fósseis. O principal objectivo desta tese foi o desenvolvimento de condições de operação de reactores SBR para a selecção de microrganismos a partir de culturas mistas com elevada capacidade de armazenamento de PHAs. Para alcançar este objectivo foram operados dois reactores descontínuos sequenciais (SBR) inoculados com lamas biológicas. Estes dois reactores operaram com um tempo total de ciclo de 12h, foram submetidos a condições dinâmicas aeróbias e alimentados com substratos orgânicos simples em que as proporções de ácido acético: ácido propiónico foram de 2:1 e 1:1, em massa, para analisar a influência da fonte de carbono na selecção de bactérias acumuladoras de PHAs. Cada um deles foi submetido a cargas crescentes de matéria orgânica (2, 4 e 8gCQO.L-1.d-1) também para análise da influência da carga na obtenção de biopolímeros. Ao longo do procedimento experimental dos reactores, foi efectuada uma monitorização microbiológica qualitativa das lamas biológicas, para verificar o estado e evolução funcional dos reactores, bem como a acumulação de polímeros. Foi também efectuada a análise de parâmetros físico-químicos para análise da evolução do funcionamento do reactor. Através da análise microbiológica qualitativa foi possível identificar e prever casos de má sedimentabilidade, bulking viscoso e bulking filamentoso, podendo desta serem tomadas medidas correctivas adequadas para cada problema. Os resultados obtidos permitem concluir que o aumento da fracção de ácido acético presente na alimentação favoreceu a acumulação de polímeros bem como o funcionamento do reactor, uma vez que não ocorreram problemas significativos à excepção da última carga. Para os cenários estudados foi para a proporção ácido acético e ácido propiónico, 2:1, que o tempo de degradação da matéria orgânica foi mais rápido, em apenas 1h, indicando que se estariam a seleccionar bactérias acumuladoras de PHAs. Através da análise microbiológica, foi possível confirmar a selecção de bactérias com capacidade de acumulação de PHAs para as condições impostas para este reactor. Os resultados obtidos através da análise microscópica, para visualização de polímeros, com os testes Negro de Sudão e Azul do Nilo, vieram a demonstrar que o corante Negro de Sudão pode ser utilizado como análise prévia de visualização de polímeros mas a sua existência tem de ser comprovada através da análise do teste Azul do Nilo, devido à sua maior especificidade para corar grânulos de polihidroxialcanoatos (PHAs). Por análise microscópica, através do teste Azul do Nilo, verificamos que a influência do aumento da carga orgânica se reflectiu no aumento de biopolímeros acumulados para o reactor com maior concentração de ácido acético, ou seja o aumento da carga continuou a favorecer a selecção de bactérias com maior capacidade de armazenamento de PHAs. Estes resultados indicam que a produção de PHAs por culturas mistas é uma alternativa real à utilização de culturas puras, para produção de biopolímeros. Porém, ainda devem ser alvo de estudo de forma a rentabilizar e tornar viável a produção de biopolímeros a nível industrial, em comparação à produção de polímeros sintéticos.

The developed work comes as an answer to the current need of reducing the amount of residues dropped into the environment, namely plastics, as well as to increase de use of renewable resources of industrial processes. Within this context, synthetic plastics are now a major problem due to this high resistance to biodegradation and consequent accumulation, so biological derived polyesters, known as polyhydroxyalkanoato (PHA) represent a potentially sustainable replacement to fossil fuel based thermoplastics. The main objective of this thesis was the development of the operational conditions of sequencing batch reactors (SBR) for the selection of microorganisms from mixed cultures with high capacity for PHA storage. In order to achieve this objective, two SBR reactors were operated and inoculated with activated sludge. These two reactors operated with a total cycle of 12h, were submitted to dynamic and aerobic conditions, and being feed with simple organic substrates at two different proportions of acetic acid: propionic acid 2:1 and 1:1, in order to analyze the influence of the carbon source in the process of selecting PHA storing bacteria. Each reactor was submitted to increasing loads of organic matter (2, 4 and 8gCQO.L-1.d-1) for evaluation of the load effect on the amount of produced polymers. Along the experimental procedure of the reactors, it was done a qualitative microbiologic monitoring of the biological sludge in order to verify the reactor performance, as well as the PHA storage. It were also performed the physical and chemical analyzes with the same purpose. Through the qualitative microbiologic analysis it was possible to identify and predict settling problems, viscous and filamentous bulking, making it possible to take in advance adequate measures for each problem. The results obtained allowed the conclusion that the increase of the fraction of acetic acid present in the feed benefited the storage of polymers as well as the behaviour of the reactor, since no meaningful problems occurred with the exception of the last load. Considering the studied scenarios it was the proportion of acetic acid: propionic acid, 2:1, where the organic load added was degraded more quickly, taking just one hour, indicating that PHA storage bacteria were being selected. Through the microbiologic analysis, It was possible to confirm the selection of PHA storage bacteria for the imposed condition in this reactor. The results obtained with microscopic analysis, for visualizing polymers, with Sudan Black and Nile Blue tests demonstrated that the corant Sudan Black can be used as a previous analysis for polymer visualization but its presence must be confirmed through the Nile Blue test, due to it’s great specificity for coloring granules of PHA. By microscopic analysis, using Nile Blue test it was verified that the influence of increasing the organic load was reflected also in an increase of accumulated polymers for the reactor with the higher concentration of acetic acid, which means that the increase on the load continued to benefit the selection of bacteria with the higher capacity for PHA store. This results show that the production of PHA by mixed cultures is a potential alternative to the use of pure cultures for producing biopolymers. However, they still need to be the target of further research in order to increase the efficiency of the process and make viable the production of biopolymers at a industrial level, in comparison to the production of synthetic polymers.