Broad host range plasmids in estuarine environments

Abstract

A transferência horizontal de genes permite a adaptação microbiana a nichos especiais, dos quais dois bons exemplos são a camada superficial do mar e a coluna de água. Os plasmídeos com gama alargada de hospedeiros (BHR), responsáveis pelo fluxo de material genético entre cromossomas bacterianos (inclusivamente entre microorganismos muito afastados filogeneticamente) têm um papel essencial na evolução das comunidades microbianas. Entre eles, os plasmídeos pertencendo ao grupo de incompatibilidade IncP-1 têm um interesse especial por causa da sua extraordinária flexibilidade na iniciação da replicação e da estabilidade na sua manutenção numa ampla gama de hospedeiros. Estes elementos genéticos móveis, além de constituírem ferramentas úteis na engenharia genética, representam uma grande fonte de genes que codificam para características tão significativas como a resistência a antibióticos e a degradação de xenobióticos. No entanto, a diversidade nesta família de plasmídeos BHR tem sido subestimada até agora: actualmente sabe-se da existência de cinco subgrupos divergentes, mas embora alguns plamídeos modelo tenham sido estudados ao detalhe, ainda há muito para investigar. Em trabalhos anteriores na Ria de Aveiro (costa NW de Portugal), foi feita a captura exógena de plasmídeos bem como o isolamento de bactérias potencialmente hospedeiras de plasmídeos endógenos. Neste trabalho, sequências de nucleótidos específicas foram amplificadas mediante reacções em cadeia da polimerase para determinar a presença de plasmídeos BHR. Os sete plasmídeos IncP-1 detectados, foram em primeiro lugarfilogeneticamente estudados. O alinhamento das sequências de nucleótidos de 281 pb que foram amplificadas e que correspondem a um fragmento do gene trfA (que codifica para uma proteína do início da replicaçao) sugeriu o estabelecimento de dois novos clusters situados filogeneticamente em dois subgrupos diferentes de IncP-1: IncP-1β e o recentemente descrito IncP-1ε. Estes constituem os primeiros replicões IncP-1 provenientes de ambientes estuarinos a serem detectados e isolados. De seguida, uma comparação e caracterização preliminar genética e fenotípica foi realizada com os plasmídeos purificados, considerando a descrição já conhecida dos dois plasmídeos arquétipos evolutivamente mais próximos, pB10 e pKJK5. Assim, as análises de fragmentos de restrição, determinação da inibição do crescimento do hospedeiro na presença de mercúrio e ensaios de resistência a diferentes antibióticos ajudaram a compreender o elevado interesse que recai nestes plasmídeos revelando a diversidade fenotípica e genotípica. Uma completa descrição de qualquer destes novos plasmídeos pode ter una enorme importância ecológica, evolutiva e biotecnológica, incrementada pela sua procedência dum ambiente não clínico. Portanto este trabalho justifica um estudo em maior profundidade destes replicões promíscuos.

The horizontal gene transfer allows microbial adaptation to special niches, from which the sea-surface microlayer or the subsurface waters in estuarine environments might be good examples. Broad host range plasmids, responsible for the reshuffling of genetic material between bacterial chromosomes (even amongst distantly related microorganims), play an essential role on the evolution and diversity of microbial communities. Among them, the incompatibility group IncP-1 plasmids have a special interest due to their extraordinary flexibility in the replication initiation and stable maintenance in such a wide spectrum of hosts. These mobile genetic elements, in addition to the helpful genetic engineering tools they mean, represent a great source of potentially useful genes encoding for traits as significant as antibiotic resistance or xenobiotic degradation. Nevertheless, the diversity of this family of BHR plasmids has been underestimated until recently: it is currently known to have five divergent sub-groups, but although some prototype plasmids have been studied in great detail, there is still much left to research. In previous investigations exogenous plasmid capture was carried out as well as putative endogenous plasmid bacterial hosts isolated in the Ria de Aveiro lagoon (NW coast of Portugal). In this work, polymerase chain reactions were developed to amplify specific nucleotide sequences and determine BHR plasmids presence. From a bioinformatical approach, the seven IncP-1 plasmids detected were firstly phylogenetically studied. The alignment of the amplified 281 bp nucleotide sequences corresponding to a fragment of the replication initiation protein encoding gene trfA suggested the formation of two novel clusters belonging to two different IncP-1 plasmid subgroups: IncP-1β and the lately described IncP-1ε. Additionally, these represent the first estuarine IncP-1 replicons to be detected and isolated. Then a preliminary genetic and phenotypic comparison was performed with the purified plasmids, by taking into account the known description of the evolutionary closest models, pB10 and pKJK5. That way, restriction fragment analysis as well as antibiotic and mercury resistance determination assays helped to comprehend the high significance falling on the captured plasmids by revealing the genetic and phenotypic diversity. A whole description of any of these novel plasmids may have a huge ecological, evolutionary and biotechnological importance, even more due to its precedence from a non-clinical environment. Therefore this work justifies further studies on these promiscuous replicons.