Biotechnological potential of Pedobacter lusitanus NL19 a new specie isolated from sludge from an uranium mine in Portugal

Abstract

Bioactive natural products (BNPs) play an important role in our daily lives, especially as therapeutic agents. One example is antibiotics, which have been widely used in human health. The inappropriate use of these antibiotics has led to an increase in bacterial resistance, which is a problem of worldwide concern, warning for the urgent need for new effective alternatives. Extreme environments have already proven to be a rich source of microorganisms producing new chemical entities with important biological properties, namely antimicrobials. In the present study one such environment was explored. We have isolated several bacteria from sludges contaminated with radionuclides and metals, collected from a uranium mine run-off in Quinta do Bispo, Viseu, Portugal. One strain was selected based on its broad activity against Grampositive and Gram-negative bacteria, and also yeasts, with relevance in the clinical, food, veterinary and aquaculture settings. The phylogenetic analysis of the 16S rRNA, gyrB and Internal Transcribed Spacer (ITS) gene sequences identified this strain as belonging to the genus Pedobacter, and having P. himalayensis, P. cryoconitis, P. westerhofensis and P. hartonius as closely related species. Further polyphasic analysis showed that the strain is a new bacterial species, and which was named Pedobacter lusitanus NL19. In silico analysis of NL19 genome sequence revealed the presence of 17 biosynthetic gene clusters (BGCs) for different classes of BNPs, including nonribosomal peptide (NRPs), polyketides (PKs), ribosomally synthesized and posttranslationally modified peptides (RiPPs), siderophores, terpenes and several hybrid NRPs-PKs. NL19 bioactivity was detected in solid medium but not in its equivalent broth. Further investigations showed that a high concentration of peptone from casein (PC) was the main factor associated with the lack of bioactivity by NL19 in broth. On the contrary, in broth with a low concentration of PC, the compounds produced by NL19 showed a broad spectrum of activity against bacteria and yeasts. Furthermore, the bioactivity detected was mainly due to the presence of pedopeptins, which are NRPs and whose genes are present in the NL19 genome. These results were supported by RNA-seq and validated by qPCR, which showed that the transcription of pedo_nrps genes was significantly downregulated in cells grown in a high concentration of PC. Also, NL19´ RNA-seq transcriptome data in high and low PC concentrations, allowed us to identify 261 differentially expressed genes (DEGs). In general, at high concentrations of PC, in addition to the genes involved in pedopeptins biosynthesis, genes involved in the de novo biosynthesis of biotin were also found to be significantly downregulated. In this condition genes that encode putative efflux pumps as well as ferrous iron capture system, were significantly upregulated, which suggests redirection of cellular metabolism. Genome mining approaches also revealed that NL19 and its closely related species have an important collection of new NRPS-BGCs. Finally, the pan-genome analyses highlight the genus Pedobacter as a prolific source of relevant new BNPs including NRPs, PKs, RiPPs, hidroxamate, carotenoids and squalene, mainly the NL19 and P. cryoconitis species. The work developed reinforces the relevance of bioprospecting extreme environments. The characterization of the strain P. lusitanus NL19 reveals the enormous, yet still untapped, biotechnological potential of this strain, and also of other members of the genus Pedobacter, for the discovery of new compounds with diverse biotechnological applications, including therapeutic ones.

Os produtos naturais bioativos (BNPs) têm um grande impacto no nosso quotidiano, principalmente como agentes terapêuticos. Um exemplo são os antibióticos, que têm sido amplamente usados na melhoria da saúde humana. O uso inadequado destes antibióticos tem levado ao crescente aumento de resistência bacteriana, sendo esta uma preocupação mundial que obriga a explorar novas alternativas eficazes. Os ambientes extremos têm mostrado ser uma rica fonte de microrganismos produtores de novas entidades químicas, com importantes propriedades biológicas, nomeadamente, antimicrobianas. No presente estudo explorámos um desses ambientes. Isolámos várias bactérias a partir de lamas contaminadas com radionuclídeos e metais, que foram recolhidas na mina de urânio desativada na Quinta do Bispo, Viseu-Portugal. Um isolado bacteriano foi selecionado por apresentar amplo espetro de atividade contra bactérias de Gram-positivo, de Gram-negativo, e também leveduras, com relevância nas áreas clínica, alimentar, veterinária e aquacultura. Esse isolado foi identificado e caracterizado por análises filogenéticas das sequências dos genes 16S rRNA, gyrB e de espaçadores do transcrito interno (ITSs), como pertencendo ao género Pedobacter e tendo como espécies próximas P. himalayensis, P. cryoconitis, P. westerhofensis e P. hartonius. A análise polifásica revelou ser uma nova espécie bacteriana a que se deu o nome Pedobacter lusitanus NL19. A análise in silico do seu genoma revelou a presença de 17 agrupamentos de genes biossintéticos (BGCs) para diferentes classes de BNPs, incluindo péptidos não ribossomais (NRPs), policétidos (PKs), péptidos ribossomais pós-traducionalmente modificados (RiPPs), sideróforos, terpenos e vários NRPs-PKs híbridos. A bioatividade da NL19 foi detectada quando a bactéria foi cultivada em meio sólido, mas não no meio líquido equivalente. Verificámos ainda que elevadas concentrações de peptona de caseína (PC) afectam a bioatividade da NL19 quando cultivada em meio líquido e que os compostos produzidos a baixas concentrações de PC têm atividade contra bactérias e leveduras. A bioatividade detectada foi associada à presença das pedopeptinas, que são NRPs e cujos genes estão presentes no genoma da NL19. Estes dados foram suportados pelos resultados da análise por RNA-seq e validados por qPCR, que mostram que os genes pedo_nrps se encontram significativamente subexpressos em células cultivadas em elevadas concentrações de PC. Para além disso, os dados obtidos da análise do transcriptoma da NL19 cultivada em elevadas e baixas concentrações de PC, permitiram identificar 261 genes diferencialmente expressos (DEGs). De uma forma geral, em concentrações elevadas de PC, para além dos genes envolvidos na biossíntese das pedopeptinas, também os genes envolvidos na biossíntese de novo da biotina se encontravam significativamente subexpressos. Nesta condição, os genes codificantes para bombas de efluxo, bem como para um sistema de captura de ferro ferroso, estavam significativamente sobreexpressos, sugerindo um redirecionamento do metabolismo celular. A mineração do genoma revelou ainda que a NL19 e as espécies próximas atrás referidas, possuem uma importante coleção de novos NRPS-BGCs. Finalmente, a análise dos pangenomas revelaram que o gênero Pedobacter, nomeadamente, as espécies NL19 e P. cryoconitis, é fonte prolífica de novas classes de BNPs, incluindo NRPs, PKs, RiPPs, hidroxamato, carotenóides e esqualeno. Os resultados obtidos ao longo deste trabalho reforçam a relevância da bioprospecção dos ambientes extremos. Para além disso, a caracterização da estirpe P. lusitanus NL19, e de outras espécies próximas, revela o enorme, mas ainda inexplorado, potencial biotecnológico desta estirpe, bem como de membros do género Pedobacter, para a descoberta de novos compostos com diversas aplicações biotecnológicas, inclusive terapêuticas.