Marine fungi: diversity and biotechnological potential

Abstract

Marine fungi are a prolific group of organisms that have been largely neglected for a long time. Over the last years, attention turned to the marine environment, with the recognition that marine organisms represent a rich source of natural products. The marine mycobiome has many species still to be identified and the ones known still underutilized for biotechnological applications. In Portugal, despite its very large coastline and privileged relationship with the sea, there are only few studies on marine fungi. Thus, the main goal of this thesis was to contribute to disclose the untapped diversity and the biotechnological potential of the marine mycobiome from the Portuguese coastline and in the estuary of Ria de Aveiro. To achieve this, three different approaches were used. First, fungi were isolated from algae, drift- and submerged wood, saline water, and sponges. The 1312 isolates obtained were initially subjected to microsatellite-primed PCR to analyze the genetic fingerprinting patterns to separate and discriminate different groups in the collection. From this collection, 243 different fungal species were identified based on DNA sequence data. Eighteen fungal species and one new genus were identified, which were circumscribed based on morphological and phylogenetic analysis. Furthermore, some taxonomic ambiguities have been resolved. Secondly, eight fungal strains were selected for biological activities characterization based on their enzymatic profile and antibacterial activity. Mycelia aqueous extracts and culture media methanolic extracts, obtained from liquid fermentation, were characterized regarding their antibacterial, antifungal, antioxidant, and cytotoxic activities. In addition, the effect of sea salt on fungal bioactivities was evaluated. In general, the extracts of Aspergillus affinis, Penicillium lusitanum, Emericellopsis cladophorae and Trichoderma aestuarinum were able to inhibit the growth of pathogenic bacteria and fungi. Our results also demonstrated that the activity profiles from the extracts of the marine fungi studied were different in response to the presence of sea salt. Finally, A. affinis and E. cladophorae were characterized in more detail with their metabolomes and genomes sequenced. Both species contain many unknown biosynthetic gene clusters, genes encoding for osmolytes’ biosynthetic processes, ion transport systems, and are rich in carbohydrate active enzymes, which can contribute to understand their adaptation to the marine environment. Furthermore, the compound library built from the crude extracts for both species confirmed the presence of antifungal, antibacterial, antitumor, antiviral, and anti-inflammatory metabolites. The outcome of this work confirmed that the marine mycobiome is highly diverse and can yield novel marine fungal taxa which must continue to be explored contributing to unveil their biodiversity, ecological importance, and natural products research.

Os fungos marinhos são um grupo prolífico de organismos que tem sido amplamente negligenciado. Ao longo dos últimos anos, as atenções voltaramse para o meio marinho, com o reconhecimento de que os organismos marinhos constituem uma rica fonte de produtos naturais. O micobioma marinho tem muitas espécies ainda por desvendar e subutilizadas para aplicação biotecnológica. Em Portugal, apesar da extensa linha costeira e da relação privilegiada com o mar, são poucos os estudos sobre fungos marinhos. Assim, o objetivo desta tese foi contribuir para a divulgação da diversidade e do potencial biotecnológico contido no micobioma marinho da costa portuguesa e no estuário da Ria de Aveiro. Para isso, três abordagens foram utilizadas. Primeiro, os fungos foram isolados de algas, madeira à deriva e submersa, água salgada e esponjas. Obtiveram-se 1312 isolados que foram inicialmente submetidos a MSP-PCR para analisar os padrões de impressão digital genética para discriminar diferentes grupos na coleção. Desta coleção, foram identificas 243 espécies diferentes de fungos com base em dados de sequência de DNA. Foram identificadas dezoito novas espécies e um novo género, que foram descritos com base em análises morfológicas e filogenéticas. Além disso, algumas ambiguidades taxonómicas foram resolvidas. Em segundo lugar, oito estirpes de fungos foram selecionadas para a caracterização de bioatividades com base nos seus perfis enzimáticos e atividades antimicrobianass. Os extratos aquosos dos micélios e os extratos metanólicos dos meios de cultura obtidos por fermentação líquida foram caracterizados quanto às atividades antibacteriana, antifúngica, antioxidante e citotóxica. De um modo geral, os extratos de Aspergillus affinis, Penicillium lusitanum, Emericellopsis cladophorae e Trichoderma aestuarinum apresentaram atividade contra bactérias e fungos patogénicos. Os resultados demonstraram também que os perfis de atividade dos extratos destes fungos marinhos são diferentes em resposta à presença de sal marinho. Por fim, A. affinis e E. cladophorae foram estudados mais detalhadamente, caracterizando-se os seus metabolomas e genomas. Ambas as espécies contêm grupos de genes biossintéticos desconhecidos, genes que codificam processos biossintéticos de osmólitos e sistemas de transporte de iões, e são ricas em enzimas com atividade sobre hidratos de carbono, o que pode contribuir para entender a sua adaptação ao ambiente marinho. Além disso, a biblioteca de compostos construída a partir dos extratos brutos para ambas as espécies confirmou a presença de metabolitos antifúngicos, antibacterianos, antitumorais, antivirais e anti-inflamatórios. O resultado deste trabalho confirmou que o micobioma marinho é altamente diversificado e pode ter novos taxa de fungos marinhos que devem continuar a ser explorados contribuindo para desvendar a sua biodiversidade, importância ecológica e pesquisa de produtos naturais.