In vivo and in vitro ecotoxicity assessment of pharmaceuticals and nanoplastics for early life stages of amphibians

Abstract

The technological expansion allowed the development of active substances that promoted an improvement of human life quality and a population increase. However, the increase in the consumption of pharmaceutical substances, in terms of quantity and variety, has promoted its environmental presence, namely in aquatic systems. Considering the bioactive nature of these substances, undesirable effects may be expected in the biota inhabiting ecosystems that receive these chemicals. Among this biota are the amphibians, which constitute a group of organisms that shows a high sensitivity to environmental changes. The present study aimed to assess the individual and combined effects of two pharmaceutical drugs (propranolol and haloperidol), alone and in combined exposures with nanoplastics (50 nm polystyrene particles), to aquatic life stages (embryos and tadpoles) of Xenopus laevis and Pelophylax perezi. Assessed endpoints included mortality, malformations and growth (as length and weight). Furthermore, effects of the selected xenobiotics on two amphibian cell lines (A6, an epithelial line derived from the kidney of an adult male; and XTC-2, a fibroblast-like line derived from a tadpole) were assessed using in vitro assays, by monitoring cell viability, to validate its relevance as a non-animal alternative to assess potential risks to amphibians. Thus, embryos and tadpoles of X. laevis and P. perezi and the two cell lines (A6 and XTC-2) were exposed to pharmaceuticals and nanoplastics, alone or in binary mixtures. Overall, the results showed that X. laevis tadpoles were more sensitive than the respective embryos to the tested pharmaceuticals. When comparing the two species, the tadpoles of X. laevis tended to be slightly more sensitive than those of P. perezi. Single exposure to 50 nm polystyrene nanoplastics caused no effects on the selected endpoints (lethal or non-lethal), despite their ingestion by the tadpoles. The comparison of the two selected approaches, in vivo versus in vitro, revealed that the latter were less sensitive to the pharmaceuticals. In vitro, individual exposure to polystyrene nanoplastics caused no significant effects on the cell viability of the tested cell lines. However, in mixtures, significant effect of its presence was observed for A6 cell lines, which revealed to be more sensitive than XTC-2 cell line. In vivo, for the pharmaceuticals drugs, the mixture caused a higher mortality at a lower concentration of nanoplastics, demonstrating the relevance of testing environmentally relevant concentrations of xenobiotics and the need to fully characterize nanoplastics in the test media (e.g., concentration, size, ability to form aggregates).

A expansão tecnológica permitiu o desenvolvimento de substâncias ativas que promoveram uma melhoria de qualidade da vida humana e um aumento populacional. No entanto, o aumento do consumo de substâncias farmacêuticas, em termos de quantidade e variedade, promoveu a sua presença ambiental, nomeadamente nos sistemas aquáticos. Considerando a natureza bioativa destas substâncias, podem esperar-se efeitos indesejáveis na biota presente nos ecossistemas que recebem estas substâncias químicas. Entre esses organismos encontram-se os anfíbios, organismos que demonstram uma elevada sensibilidade às mudanças ambientais. O presente estudo visou avaliar os efeitos individuais de dois fármacos (propranolol e haloperidol), isoladamente e em exposições combinadas com nanoplásticos (partículas de poliestireno de 50 nm), para diferentes fases da vida aquática (embriões e girinos) de Xenopus laevis e Pelophylax perezi. Os parâmetros avaliados incluíram mortalidade, malformações e efeitos no crescimento. Adicionalmente, foram avaliados os efeitos in vitro dos xenobióticos selecionados, em duas linhas celulares (A6, uma linha epitelial derivada do rim de um macho adulto; e XTC-2, uma linha fibroblástica derivada de um girino), avaliando a viabilidade celular, de forma a validar a sua relevância como uma alternativa não animal para avaliar os riscos potenciais para os anfíbios. Assim, embriões e girinos de X. laevis e P. perezi e as duas linhas celulares (A6 e XTC-2) foram expostos aos fármacos e nanoplásticos, sozinhos ou em misturas binárias. Globalmente, os resultados mostraram que girinos de X. laevis são mais sensíveis aos fármacos testados do que os respetivos embriões. A comparação das duas espécies revela que os girinos de X. laevis tendem a ser ligeiramente mais sensíveis do que P. perezi. A exposição individual a nanoplásticos de 50 nm de poliestireno não causou efeitos nos parâmetros avaliados (letais ou não letais), embora estes tenham sido ingeridos pelos girinos. A comparação das duas abordagens selecionadas, in vivo versus in vitro, revelou que os ensaios in vitro foram menos sensíveis aos fármacos. In vitro, a exposição apenas a nanoplásticos de poliestireno não causou efeitos significativos sobre a viabilidade celular das linhas celulares testadas. Contudo, nas misturas, observou-se um efeito significativo da sua presença, com as linhas celulares A6 a revelarem-se mais sensíveis do que a linha celular XTC-2. In vivo, a mistura causou um aumento da mortalidade induzida pelos fármacos particularmente para a menor concentração de nanoplásticos, demonstrando a relevância de testar concentrações de xenobióticos relevantes do ponto de vista ambiental e a necessidade de caracterizar completamente os nanoplásticos nos meios de ensaio (e.g., concentração, tamanho, capacidade de formar agregados).