Extracção supercrítica de óleo de grainha de uva combinada com pré-tratamentos enzimáticos

Abstract

Neste trabalho estudou-se a extracção supercrítica do óleo de grainha de uva, usando dióxido de carbono, e combinou-se este processo com um prétratamento enzimático da semente para aumentar o rendimento global da extracção. A qualidade dos extractos obtidos foi avaliada pelo seu conteúdo em triacilglicerídeos, perfil de ácidos gordos e capacidade antioxidante. Realizaram-se também alguns estudos exploratórios sobre a aplicação de um pré-tratamento de alta pressão (HPP) à grainha da uva. Adicionalmente, efectuou-se o estudo da extracção, fraccionamento e caracterização estrutural das procianidinas da grainha da uva, bem como a avaliação da sua capacidade antioxidante. A extracção de procianidinas da grainha da uva foi efectuada sequencialmente com metanol e acetona/água, tendo sido posteriormente fraccionadas por adição sucessiva de misturas metanol/clorofórmio progressivamente mais concentradas em clorofórmio. A caracterização das procianidinas foi feita por HPLC-UV e LC–MS, antes e depois de sujeitar as amostras a uma tiólise, e também por ESI-MS e ESI-MS/MS. Este estudo permitiu reportar, pela primeira vez, a ocorrência de procianidinas do tipo-A galoiladas na grainha da uva. Os resultados de HPLC-UV permitiram determinar o grau médio de polimerização das procianidinas e a sua composição monomérica em (+)- catequina, (-)-epicatequina e (-)-epicatequina-O-galato. Mostrou-se que a (+)- catequina é o flavan-3-ol terminal mais abundante e a (-)-epicatequina predomina largamente como unidade de extensão. No caso de procianidinas do tipo A, a ligação interflavânica C2-C7 encontra-se essencialmente nas unidades terminais. O grau médio de polimerização das diversas fracções varia entre 1.0 e 10.8. A sua capacidade antioxidante, medida pelo método espectrofotométrico de DPPH•, mostrou-se ser equivalente à de uma amostra comercial de (+)-catequina usada como referência. A partir dos graus médios de polimerização experimentais e das análises de FTIR das fracções correspondentes foi possível obter um modelo preditivo O-PLS com apenas uma variável latente. O pré-tratamento enzimático justificou-se pelo conhecimento existente acerca do uso de enzimas específicas que destroem parcialmente as paredes celulares. Atendendo à composição das paredes celulares da grainha da uva preparou-se uma suspensão contendo protease, xilanase, pectinase e celulase. Para determinar as condições experimentais do pré-tratamento que maximizam o rendimento da extracção, estudou-se o efeito do tempo de reacção, temperatura, pH, diâmetro médio das partículas de grainha moída e a concentração das enzimas. Os incrementos do rendimento da extracção de óleo observados atingiram 163.2%. O estudo da extracção supercrítica (SFE) do óleo da grainha de uva tratada e não-tratada permitiu obter as curvas de extracção correspondentes, bem com analisar a influência das condições operatórias sobre o seu andamento. Montou-se uma instalação laboratorial onde se realizaram experiências com dióxido de carbono a 160, 180, 200 e 220 bar e temperaturas de 313.15 e 323.15 K. Os rendimentos obtidos por SFE foram semelhantes aos de Soxhlet com n-hexano. As curvas de extracção medidas compreendem um primeiro período de extracção, onde se remove cerca de 92-97% do óleo disponível, e um segundo período, essencialmente difusional, com pouco impacto no rendimento final. Os vários extractos recolhidos e o óleo global obtido foram caracterizados para avaliar a sua qualidade e relacioná-la com as condições operatórias de SFE. Determinaram-se o conteúdo total em triacilglicerídeos, o seu perfil de ácidos gordos e a capacidade antioxidante (AOC). Os resultados mostraram que a AOC aumenta com a elevação da pressão e, acentuadamente, com o acréscimo da temperatura. Ao longo da curva de extracção, a AOC é mais pronunciada nos extractos iniciais, nomeadamente nos primeiros 30 a 40% da extracção. A modelação efectuada considerou que o óleo extractável se reparte entre células rompidas, predominantes na periferia da semente, e células intactas, mais interiores. Admitiu-se que o transporte de massa ocorre em série, i.e. das células intactas para as rompidas e destas para o solvente; mostrou-se que a dispersão axial era desprezável. Os balanços materiais à fase fluida e aos volumes de células rompidas e intactas, combinados com os fluxos interno, externo e a relação de equilíbrio foram resolvidos numericamente pelo método das linhas combinado com diferenças finitas atrasadas. O modelo reproduziu bem as curvas experimentais e permitiu simular curvas de eluição e os três perfis de concentração no leito.

The supercritical extraction of grape seed oil with carbon dioxide has been studied and combined with an enzymatic pre-treatment of the seed to enhance the global extraction yield. The quality of the attained extracts has been assessed by evaluating the content in triacylglycerides, fatty acids profile, and antioxidant capacity. An exploratory study with the application of a high pressure pre-treatment (HPP) to the seed has also been considered. Additionally, the extraction, fractionation, and structural characterization of grape seed procyanidins, as well as the evaluation of their antioxidant capacity, has been carried out. The procyanidins were sequentially extracted with methanol and acetone/water from defatted seed, and further fractionated by precipitation in graded methanol/chloroform solutions. The procyanidins analysis included HPLC-UV and LC–MS, before and after thiolysis, as well ESI-MS e ESI-MS/MS. Such study allowed to report, for the first time, the occurrence of type-A galloylated procyanidins. The average degree of polymerization and the monomeric composition in (+)-catechin, (-)-epicatechin and (-)-epicatechin-O-gallate, were obtained using HPLC-UV. The results, showed (+)-catechin as the most abundant flavan-3-ol terminal unit, and the high predominance of (-)-epicatechin as the extension unit. In type-A procyanidins the C2-C7 interflavanic linkage appears essentially in the terminal units. The collected fractions presented an average degree of polymerization range from 1.0 to 10.8. Their antioxidant capacity, assessed by the DPPH• spectrophotometric method, presented a similar response to a commercial standard of (+)-catechin. A predictive O-PLS method, with one latent variable, was obtained using the experimental average degree of polymerization determined and combined with FTIR analyses. The enzymatic pre-treatment approach was based on the knowledge that partial hydrolysis of the cell walls can occur by means of appropriate enzymes. With the given composition of grape seed walls four types of enzymes were considered, namely protease, xylanase, pectinase, and cellulase as the enzymatic cocktail. The effect of reaction time, temperature, pH, grape seed average particle sizes and enzymes concentration were considered in the search for extraction yield improving conditions. The increments in the extraction yield attained 163.2%. The supercritical fluid extraction (SFE) curves of grape seed oil for both treated and untreated seed were obtained and characterized on the influence of the operatory conditions on them. The supercritical extraction experiments were performed with carbon dioxide at 160, 180, 200, and 220 bar and 313.15 and 323.15 K in a semi-continuous apparatus built and assess at the University of Aveiro. The yields obtained by SFE were similar to those of Soxhlet using nhexane. The extraction curves present a first period of extraction, where about 92-97% of the available oil is removed, and a second diffusional period, with no significant impact in the final yield. The quality of the individual SFE extracts and global oil was evaluated and related to the SFE operating conditions. The total triacylglycerides content, fatty acids profile, and antioxidant capacity (AOC) of the extracts were measured. Results showed the AOC increases with increasing pressure and noticeably with rising temperature. Along extraction curves, the AOC is more pronounced on the oil collected during the first stages of the process, where 30-40% of the total oil is extracted. The modelling assumed the hypothesis of the existence of broken (peripherical) and intact cell (core) fractions in the seed. A series mass transport was assumed, i.e., from intact cells to broken cells, and from those to the solvent; axial dispersion was shown to be neglectable. The resulting mass balances to the fluid phase, broken, and intact cells, combined with internal fluxes, and the equilibrium relationship were numerically solve by applying the method of lines combined with backward finite differences. The experimental extraction curves were well reproduced by the model which allowed the simulation of the elution curves and the three concentration profiles in the bed.