Application of nuclear magnetic resonance spectroscopy and vibrational spectroscopy for the characterisation of fruit products and beverages

Abstract

O trabalho apresentado nesta tese pretendeu desenvolver e aplicar métodos espectroscópicos, em especial espectroscopia de ressonância magnética nuclear e técnicas acopladas, e também espectroscopia de infravermelho, para estudar a composição e a bioquímica de frutos e bebidas. No Capítulo I, apresenta-se o estado do conhecimento sobre a composição e bioquímica dos alimentos em análise neste trabalho, evidenciando-se os aspectos que justificam o seu estudo mais aprofundado e completo, para o qual a presente tese pretende contribuir. O Capítulo II descreve, de forma resumida, os fundamentos das técnicas analíticas utilizadas, focando nomeadamente a espectroscopia de RMN de estado líquido e de estado sólido, o acoplamento da RMN com cromatografia líquida e espectrometria de massa (HPLCRMN/ MS) e a espectroscopia de infravermelho. Os métodos de análise multivariada usados encontram-se também sumariamente descritos neste Capítulo. No Capítulo III, descreve-se a aplicação de técnicas de RMN de alta resolução para caracterizar a composição de sumo e polpa de manga. O espectro de RMN-1H do sumo (600 MHz) apresenta elevada complexidade e contém informação sobre uma vasta gama de compostos. Recorrendo a espectros bidimensionais, conseguem identificar-se cerca de 50 compostos, incluindo vários açúcares, ácidos orgânicos e aminoácidos. O fruto intacto (polpa) é estudado directamente e de forma não-invasiva por RMN de estado sólido (400 e 500 MHz), utilizando a técnica de rotação segundo o ângulo mágico (MAS) e uma sonda de alta resolução (HR-MAS). A técnica de HRMAS permite obter espectros com uma resolução seis vezes maior do que a obtida com MAS, sendo possível registar espectros 2D e caracterizar detalhadamente a composição da polpa. Comparando os espectros da polpa e do sumo respectivo, encontram-se algumas diferenças na composição em lípidos e pectinas, que se encontram em maior abundância no fruto intacto, demonstrando que a usual extrapolação da composição do sumo como composição global do fruto pode não ser totalmente aplicável. No Capítulo IV apresenta-se um estudo sistemático do processo de amadurecimento da manga (cv. Tommy Atkins), levado a cabo através de medições físico-químicas e de espectroscopia de RMN-1H de alta resolução aplicada a sumos e polpas. A quantificação de alguns componentes do sumo é efectuada por integração dos sinais de RMN, usando uma referência interna (TSP). As principais alterações de composição com o amadurecimento consistem no aumento dos teores de sacarose, alguns aminoácidos (ex. valina, alanina, ácido ?-aminobutírico), constituintes pécticos e polifenóis e na diminuição dos teores de glucose, ácido cítrico, ácido xiquímico, arginina, tirosina e fenilalanina. Uma segunda variedade estudada (cv. Haden) apresenta diferenças no processo de amadurecimento sobretudo ao nível da variação de alguns aminoácidos e compostos aromáticos. Ainda neste capítulo, um estudo preliminar sobre o efeito da refrigeração mostra que a maior parte das alterações indicadas acima são retardadas ou não ocorrem a baixa temperatura, daí resultando frutos com baixa qualidade organoléptica. O Capítulo V descreve a quantificação dos três principais açúcares do sumo de manga em função do amadurecimento, usando regressão parcial dos mínimos quadrados (PLS) aplicada a espectros de infravermelho (FTIR-ATR) e de RMN-1H. A calibração é efectuada com base em soluções padrão de glucose, frutose e sacarose, seguindo um desenho experimental triangular, com seis níveis de concentração para cada açúcar. O método de PLS-FTIR permite prever a concentração dos três açúcares com elevada exactidão, excepto no caso da glucose quando, nos últimos estágios de amadurecimento, esta atinge teores abaixo da gama de concentrações usada na calibração. Por outro lado, a aplicação de PLS aos espectros de RMN das soluções padrão e dos sumos de manga apresenta erros elevados, cuja magnitude parece depender do alinhamento dos espectros, necessitando este método de optimização. No Capítulo VI, a espectroscopia de RMN-1H de alta resolução é usada para monitorizar e identificar alterações de composição em sumos de manga sujeitos a degradação natural, aquecimento e contaminação microbiológica. Permitindo identificar muitos dos compostos que se alteram em função destes efeitos, de forma rápida e simultânea, e seguir a sua variação ao longo do tempo, a técnica de RMN revela-se promissora para a detecção de indicadores de degradação/contaminação do sumo, sendo potencialmente útil para fins de controlo de qualidade. No Capítulo VII, alguns componentes minoritários de sumo de manga, sumo de uva e vinho são investigados através do acoplamento das técnicas de RMN, cromatografia líquida e espectrometria de massa (HPLC-RMN/MS). Em particular, o sumo de manga é analisado com vista ao estudo dos hidratos de carbono menos abundantes, tendo-se alcançado uma melhor caracterização da fracção péctica. A análise de sumo de uva e vinho (extracto fenólico) destina-se a caracterizar os constituintes aromáticos destas amostras, tendose conseguido identificar vários compostos fenólicos de difícil atribuição só com base na análise directa por RMN. Os compostos identificados na uva incluem o ácido gálico e vários ácidos cinâmicos (ex. p-cumárico, transcutárico e trans-caftárico), enquanto que no vinho se detectam catequina e epicatequina, trans-resveratrol, tirosol e ácido cafeico. O Capítulo VIII centra-se na caracterização da composição química da cerveja através das técnicas de RMN e de HPLC-RMN/MS. A análise directa por RMN uni- e bidemsional (500 MHz) permite a identificação de cerca de 30 compostos, entre os quais vários ácidos orgânicos, aminoácidos e álcoois. Os oligossacarídeos de maltose (dextrinas) dão origem aos sinais mais largos e intensos do espectro, mas o elevado grau de sobreposição impede a sua caracterização estrutural. A identificação de dextrinas de diferentes tamanhos é conseguida através da análise da cerveja por HPLC-RMN/MS, que requer apenas a desgaseificação da amostra. A análise por HPLC-RMN/MS permite também confirmar a presença de vários compostos aromáticos e revelar outros não identificados só com base na análise por RMN, tais como os álcoois aromáticos 2-feniletanol, tirosol e triptofol. Finalmente, no Capítulo IX, descreve-se a análise de componentes principais (PCA) dos espectros de RMN-1H e de FTIR-ATR de um conjunto de 50 cervejas de diferentes marcas, tipos e países de origem. Por PCA dos espectros de RM N as cervejas são separadas de acordo com a sua composição em hidratos de carbono, embora alguns componentes minoritários (em particular compostos aromáticos) também contribuam para a distinção das amostras, nomeadamente em termos dos dois tipos principais ‘ale’ e ‘lager’. A aplicação de PCA aos espectros de FTIR origina a distinção das cervejas com base no seu teor alcoólico e na sua composição em hidratos de carbono. A análise canónica de correlação (CCA) entre os espectros de RMN e de FTIR mostra uma correlação elevada entre os dois domínios, permitindo identificar os sinais que variam no mesmo sentido.

The work reported in this thesis aimed at developing and applying spectroscopic methods, principally nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy and hyphenated techniques (HPLC-NMR and HPLC-NMR/MS), along with infrared spectroscopy, for studying the complex composition and biochemistry of different fruit products and beverages. Chapter I summarises some of the present knowledge about the food systems studied, giving particular emphasis to the aspects that frame the problems investigated in this thesis. The fundamentals of the analytical methods employed are shortly presented in Chapter II, focusing on the principles underlying the experiments that have been carried out in this work, namely solution and solid state high resolution 1H NMR spectroscopy, HPLC-NMR/(MS) and Fourier-transform infrared spectroscopy. The multivariate analysis methods that have been applied to the spectroscopic data are also briefly presented. In Chapter III, the application of high resolution NMR to characterise the composition of mango juice and intact pulp is described. The high field (600 MHz) 1H spectra of juices show a high degree of complexity, revealing the potential of the technique for the simultaneous detection of a wide range of components. Spectral assignment is carried out with basis on 1D and 2D spectra, resulting in the identification of about 50 components, including several sugars, organic acids and amino acids. Mango pulps are studied directly and non-invasively by techniques derived from solid state NMR, namely 1H HR-MAS NMR (400 and 500 MHz), which results in a six-fold resolution improvement compared to standard 1H MAS. HR-MAS enables 2D experiments to be carried out, thus allowing for the pulp composition to be thoroughly characterised. The pulp is found to have a richer composition in lipids and pectins than the corresponding juice, showing that the composition of the liquid phase is not fully representative of the composition of the whole fruit as usually assumed. Chapter IV presents a systematic study of the ripening process of mango (cv. Tommy Atkins), monitored by physicochemical parameters and by high resolution 1H NMR of both juices and pulps. Some juice components are quantified by integration of NMR signals, using an internal reference (TSP). Mango ripening is found to be characterised by increases in the contents of sucrose, some amino acids (e.g. valine, alanine, GABA), pectic constituents and polyphenols, and by decreases in the contents of glucose, citric acid, shikimic acid, arginine, tyrosine and phenylalanine, reflecting the complex biochemistry of ripening. The other cultivar studied (cv. Haden) is found to differ mainly in the variation patterns of some amino acids and aromatic compounds. Furthermore, a preliminary study of the effect of refrigeration on ripening shows that most changes indicated above do not occur under low temperature, resulting in fruits with poor edible quality. In Chapter V, partial least squares (PLS1) regression is applied to FTIRATR and to 1H NMR data in order to quantify the three main sugars in mango juices as a function of ripening. Calibration is based on standard solutions of glucose, fructose and sucrose, following a triangular experimental design with six concentration levels for each sugar. The PLS -FTIR method shows good predictive ability, although the accuracy of glucose determination decreases at later ripening stages, when concentrations fall below the lower limit of the concentration range used for calibration. The PLS -NMR method shows much higher prediction errors, which seem to depend on spectral alignment, and needs further optimisation.

In Chapter VI, the application of high resolution NMR to monitor the complex compositional changes of mango juices subject to natural degradation, heat treatment and microbial contamination is described. Enabling the identification of many compounds undergoing changes upon these effects, in a rapid and simultaneous manner, and their variations to be followed throughout time, the NMR technique may be regarded as a sensitive and powerful tool for detecting indicators of spoilage/contamination, being potentially useful for quality control purposes. Chapter VII describes the application of hyphenated NMR methods (HPLC-NMR and HPLC-NMR/MS) to investigate minor components in mango juice, grape juice and wine. In particular, the carbohydrate composition of mango juice is investigated and further advances in the characterisation of the pectic fraction achieved. The analysis of grape juice and wine (phenolic extract) aims at characterising their complex aromatic composition and results in the identification of several phenolic compounds, overcoming the difficulties found when using standard NMR. Gallic acid and several cinnamic acids (e.g. pcoumaric, trans-coutaric and trans-caftaric) are identified in grape juice, whereas catechin, epicatechin, trans -resveratrol, tyrosol and caffeic acid are found in the wine phenolic extract. Chapter VIII is focused on the characterisation of beer chemical composition by high resolution NMR and HPLC-NMR/MS. Direct analysis of beer by 1D and 2D NMR (500 MHz) is shown to enable the identification of about 30 components, such as several organic acids, amino acids and alcohols. Malto-oligosaccharides (dextrins) give rise to the broadest and most intense signals in the spectrum, but the strong spectral overlap hinders their structural characterisation. The identification of dextrins of different sizes is achieved by HPLC-NMR/MS of beer, preceded only by degassing of the sample. In addition, HPLC-NMR/MS is shown to be useful for confirming the identity of some aromatic compounds previously assigned by NMR alone, and for revealing new ones, such as the aromatic alcohols 2-phenylethanol, tyrosol and tryptophol. Finally, in Chapter IX, principal component analysis (PCA) is applied to the 1H NMR spectra and to the FTIR-ATR spectra of a set of 50 beers differing in label, type and country of origin. PCA of NMR data results in the separation of beers mainly according to their carbohydrate composition, although minor components (aromatic compounds in particular) are also found to contribute for the distinction of beers, namely in terms of the two main types ale and lager. PCA of FTIR data separates beers with basis on differences in their alcoholic content and carbohydrate composition. Canonical correlation analysis of NMR and FTIR spectra shows a high correlation between the two domains, enabling the identification of the spectral features varying in the same direction.