Analysis of Fig4 interfered cells and its role on the endocytic pathway

Abstract

Mutations in the inositol phosphatase Fig4 were firstly associated with Charcot-Marie-Tooth 4J (CMT4J) neuropathy, a rare recessive demyelinating form of CMT with highly variable onset and characterized by severe motor dysfunction and involvement of motor and sensory neurons. Interestingly, frameshift and other missense mutations have been reported to be responsible of Yunis-Varon syndrome and familial epilepsy with polymicrogyria extending the spectrum of phenotypes associated with FIG4 mutations. Fig4 dephosphorylates the endolysosome enriched PI(3,5)P2 to generate PI(3)P. Enlarged LAMP2 positive vacuoles with watery appearance or filled with electron dense material (depending on cell type) are found in neurons, muscle and cartilage of Fig4 null mice, suggesting a dysfunction of these compartments. However, the pathogenic mechanism(s) still remain elusive. Strikingly, the endosomal system, which is a crossroad of distinct intracellular pathways, has emerged and is still emerging as key player in various neurological disorders. This research aimed to understand the role of Fig4 in regulating the endosomal pathway in order to elucidate the pathomechanisms of these neurological disorders. Moreover, these analyses also intended to contribute to a better comprehension of phosphoinositide as regulators of membrane trafficking. To this purpose, the effects of the knockdown of Fig4 expression on the endosomal pathway were analyzed. By western blot analyses and immunofluoescence assays the homeostasis and dynamics of endosomal compartments were evaluated. Furthermore, the impact of Fig4 knockdown on cell viability was studied by performing growth curves. Fig4 knockdown was found to drastically alter the whole endo-lysosome axis: lysosomes appear as large dots and also late and early endosomes are numerous and enlarged. In addition, the levels of endocytic resistant proteins are increased, suggesting an alteration of their dynamics. These results indicate that Fig4 activity is crucial for the homeostasis and function of endosomal compartments in different cells types. The dysfunction of these pathways might underlie the pathogenesis of Fig4-associated diseases.

Mutações na inositol fosfatase Fig4 foram inicialmente associadas com a neuropatia Charcot-Marie-Tooth 4J (CMT4J), uma variante rara recessiva e desmielinizante de CMT com predominância variável em termos de idade e caracterizada por uma disfunção motora grave por envolvimento dos neurónios motores e sensoriais. Curiosamente, mutações frameshift e outros tipos de mutações missense foram reportadas por serem responsáveis pela síndrome Yunis-Varon e epilepsia familial com polimicrogirias, alargando o espectro de fenótipos associados com mutações FIG4. O Fig4 desfosforila o PI(3,5)P2, abundantemente presente em endolisossomas, de modo a gerar PI(3)P. Desta forma e dependendo no tipo de célula, encontram-se vacúolos alargados, positivos em LAMP2, com aparência aguada ou preenchidos com material denso de eletrões em neurónios, músculo e cartilagem de ratos nulos em Fig4, sugerindo uma disfunção destes compartimentos. Contudo, o mecanismo patogénico permanece intangível. Notavelmente, o sistema endossomal, responsável por encaminhar diversos tipos de vias intracelulares, emergiu e continua a emergir como elemento chave em diversas doenças neurológicas. Esta trabalho teve como objetivo compreender o papel de Fig4 na regulação da via endossomal, de modo a elucidar os mecanismos da patogénese destas doenças neurológicas. Além disso, pertendeu-se que este estudo contribuisse para uma melhor compreensão de fosfoinositídeos como reguladores de tráfego membranar. Desta forma, analisaram-se os efeitos do silenciamento de Fig4 na via endossomal. Através de análises de ensaios de western blot e de imunofluorescência, foi possivel avaliar a homeostasia e dinâmicas de compartimentos endossomais. Avaliou-se ainda o impacto do silenciamento de Fig4 no que diz respeito à viabilidade das células, efetuando curvas de crescimento. Verificou-se ainda que o silenciamento do Fig4 alterou drasticamente todo o eixo endo-lisossoma observando-se um alargamento dos lisossomas, assim como do aumento do número e alargamento dos endosomas tardios e iniciais. Além disso, os níveis de proteínas endocíticas resistentes aumentaram, sugerindo uma alteração das suas dinâmicas. Estes resultados indicam que a atividade do Fig4 é crucial para a homeostasia e funcionamento dos compartimentos endossomais em diferentes tipos de células. A disfunção destas vías poderá constituir a base de patogénse de doenças associadas a Fig4.