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http://hdl.handle.net/10773/30766
Title: | The extracellular role of DJ-1 in the regulation of signaling pathways: implications for Parkinson’s disease |
Other Titles: | O papel extracelular da DJ-1 na regulação de vias de sinalização: implicações para a doença de Parkinson |
Author: | Neves, Margarida Seco Martins Marques |
Advisor: | Anjo, Sandra Isabel dos Santos Manadas, Bruno José Fernandes Oliveira Figueira, Etelvina |
Keywords: | Parkinson’s disease DJ -1 Neuroprotection Oxidative stress Signaling pathways Interactomics Phosphorylation patterns |
Defense Date: | 12-Feb-2021 |
Abstract: | Parkinson’s disease (PD) is a progressive neurodegenerative disorder with no
cure, characterized by the loss of dopaminergic neurons in the brain's
substantia nigra pars compacta. Despite extensive research, the exac
t causes
and mechanisms leading to the development of PD are still unknown. Among
the hereditary forms of PD, mutations in the DJ
-
1 gene have been associated
with an autosomal recessive early
-onset disease type. The DJ
-1 protein plays
an important role in
the defensive response to oxidative stress, in which the
modulation of signaling pathways is pointed out as a central mechanism. While
such cytoprotective function has been most described at the intracellular level,
increasing evidence also confirm
s the ability of the protein to mediate a
protective effect from the extracellular space upon its secretion. However, the
precise mode of action of the extracellular DJ
-1 or the pathological implications
of its mutations is still misunderstood. In this sense, the
aim of this work was to
elucidate the mechanisms of action of extracellular DJ
-1 with particular
consideration to its role in signaling pathways modulation. To accomplish this,
an interatomic study was performed to identify the network of interactions
esta
blished by DJ
-
1 in the extracellular space, followed by a phospho
-motif
profiling analysis to assess the pathological impact of DJ
-1 mutants in kinase
-
related signaling.
From the interactomic analysis of the secretome of SH
-S5Y5 cells after the
addition o
f exogenous DJ
-
1 in the presence or absence of oxidative stress
, it
was possible to identify a set of 28 potential extracellular DJ
-
1
-interactors
possibly involved in the neuroprotective action exerted by DJ
-
1. Additionally,
the modulation of such interactions was also assessed in oxidative stress
conditions. The list of potential interactors identified in this work confirms an
important involvement of DJ
-1 in the modulation of signaling pathways
from the
extracellular environment. TSP1, THBR, MIF
, and CAD1
1
,
some of the binding
partners of DJ
-
1 identified in this work, are known to be involved in the
regulation of some signaling pathways such as PI3K/Akt, TGF
-β, ERK1/2, Wnt
,
and PLD
- related signaling. In turn, from the “semi
-targeted” phospho
-motif
profiling assay aimed to assess the differential modulated signaling events by
the exogenous addition of DJ
-
1 native and missense mutants M26I and E163K,
it was possible to confirm that both mutations elicited alterations in the kinase
-
mediated substrate phosphorylation profile in comparison to the condition of
WT
-DJ
-1 extracellular stimulated SH
-S5Y5 cells. In fact, a generally decreased
kinase activity was observed, with the E163K
-DJ
-1 isoform exhibiting a more
prominent impact associated with a significant reduction i
n the activity of Akt,
ATM/ATR, AMPK, CK2, CDKs
, and PKC. Nevertheless, the results also denote
that both mutants of DJ
-1 had a similar pattern of alteration in the
phosphorylation of some of the substrates analyzed
, which could be an
indication of convergent pathological mechanisms.
In conclusion, this work contributed with important knowledge into the biological
role of extracellular DJ
-1 in the modulation of signaling pathways and
elucidated the impact of mutations in the activity of the protein. Following
studies should be conducted to validate the obtained results and support the
hypotheses raised in this work. Ultimately, the presen
t findings also reflect
valuable insights into the understanding of the molecular mechanisms
implicated in PD. A doença de Parkinson (DP) é uma doença neurodegenerativa progressiva sem cura, que é caracterizada pela perda de neurónios dopaminérgicos na substantia nigra pars compacta no cérebro. Apesar da ampla investigação, as causas e mecanismos exatos que despoletam o seu desenvolvimento permanecem desconhecidos. Entre as formas hereditárias da DP, mutações no gene DJ-1 foram associadas a um tipo autossómico recessivo da doença com início precoce. A proteína DJ-1 tem um papel fundamental na resposta defensora ao stress oxidativo, na qual a modulação de vias de sinalização revela ser um mecanismo central. Embora essa função citoprotetora tenha sido mais estudada a nível intracelular, crescentes evidências também comprovam a capacidade da proteína de desencadear um efeito protetor ao nível extracelular quando secretada. Porém, o modo de ação da DJ-1 no ambiente extracelular bem como as implicações patológicas de mutações da proteína nessa função permanecem por clarificar. Neste sentido, o objetivo deste trabalho foi elucidar os mecanismos de ação da DJ-1 extracelular, considerando em particular o seu papel de regulação de vias de sinalização. Para tal, foi realizado um ensaio de interactómica para identificar a rede de interações estabelecidas pela DJ-1 no espaço extracelular, seguido de uma análise semi-direccionada para avaliar o impacto patológico de formas mutantes da proteína na sinalização mediada por cinases. O ensaio de interatómica realizado em secretomas de células SH-SY5Y após a adição extracelular de DJ-1 na presença ou ausência de stress oxidativo permitiu identificar um grupo de 28 potenciais interatores extracelulares da DJ1, que poderão estar envolvidos na ação neuroprotetora mediada pela proteína. Além disso, foi também determinada a modulação destas interações em condições de stress oxidativo. Os potenciais interatores encontrados confirmam um importante envolvimento da DJ-1 na modulação de vias de sinalização a partir do espaço extracelular. TSP1, THBR, MIF e CAD11, alguns dos potenciais interatores da DJ-1 identificados neste trabalho, estão envolvidos na regulação de diversas vias de sinalização, tais como: PI3K/Akt, TGF-β, ERK1/2, Wnt e PLD. Por sua vez, da análise “semi-direccionada” de perfis de fosforilação focada na identificação dos eventos de sinalização mediados diferencialmente pela adição exógena de DJ-1 nas formas nativa ou associadas às mutações missense M26I e E163K, foi possível confirmar que ambas as mutações consideradas promoveram alterações no perfil de fosforilação mediada por cinases, em comparação com a adição extracelular da forma nativa da proteína DJ-1 em células SH-SY5Y. De facto, foi observada uma diminuição geral de atividade de cinases, e a isoforma E163K-DJ-1 exibiu um maior impacto levando a um significativo decréscimo de atividade das cinases Akt, ATM/ATR, AMPK, CK2, CDKs e PKC. Porém, os resultados também denotam que as duas formas mutantes da proteína exibem um padrão semelhante de alteração de fosforilação de alguns substratos, o que poderá ser uma indicação de potenciais mecanismos patológicos convergentes. Assim, o presente trabalho contribuiu para o aumento do conhecimento do papel extracelular da DJ-1 na regulação de vias de sinalização e permitiu verificar o impacto de mutações na atividade da proteína. Deverão ser conduzidos estudos posteriores de forma a validar os resultados obtidos e corroborar as hipóteses apresentadas. Por fim, as evidências adquiridas refletem também informações relevantes para a compreensão dos mecanismos moleculares implicados na DP. |
URI: | http://hdl.handle.net/10773/30766 |
Appears in Collections: | UA - Dissertações de mestrado DBio - Dissertações de mestrado DQ - Dissertações de mestrado |
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