Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10773/30709
Title: Exploring the impact of gastric cancer extracellular vesicles glycosylation in cancer communication
Other Titles: Explorar o impacto da glicosilação das vesículas extracelulares de cancro gástrico na comunicação em cancro
Author: Ramos, Cátia Alexandra Coelho
Advisor: Freitas, Daniela Sofia Pereira
Reis, Celso Albuquerque
Ferreira, Rita Maria Pinho
Keywords: Gastric cancer
Glycosylation
Truncated O-glycans
Sialyl-Tn
Extracellular vesicles
Migration
Defense Date: 4-Feb-2021
Abstract: Tumor cells acquire aberrant glycosylation structures at their surface. One of the most abundant glycosylation modifications present in gastric cancer tissues is the increased expression of truncated O-glycans, such as the sialyl-Tn (STn), which are associated with patients’ poor survival. Interestingly, some of the tumor-associated glycans have already been identified in cancer extracellular vesicles (EVs). Important results from our group have also demonstrated the effect of premature truncation of O-glycans (truncated Oglycans) in modulating the cells aggressive phenotypic behaviour. The general aim of this project was to explore the impact of STn positive EVs in cancer communication, namely in the modulation of the migration capacity of recipient cells. It was hypothesized that the EVs released by cancer cells with more aggressive features could influence the phenotypic behaviour of the recipient cells, namely their migration capacity. In this project, we used the genetically modified gastric cancer cell line, MKN45 SimpleCell (SC), that homogeneously overexpresses the truncated Oglycans Tn and STn, and the wild type version of this model, the MKN45 WT. To achieve this goal, it was first necessary to optimize the best cell culture conditions and the appropriate EV isolation protocol. We study the effects of removing the fetal bovine serum (FBS) from the culture medium for 48h and 72h on cell viability and proliferation rate. In addition, we assessed the impact of using a medium concentration step in the EV isolation protocol. EVs were then characterized by transmission electron microscopy (TEM) and nanoparticle tracking analysis (NTA). The presence of a panel of known EV markers, as well as the presence of the truncated O-glycan STn, were evaluated by western blotting. Finally, the role of STn positive EVs on the modulation of the migration capacity of recipient cells was also assessed. Results showed that removing the FBS from the culture medium for 48h or 72h did not affect the viability of both MKN45 WT and SC cells. Therefore, we opted to collect the EVs after growing the cells for 72h in medium without FBS. In addition, a better EV yield was achieved when isolating the EVs without the medium concentration step when compared to the protocol with this additional step. TEM images showed the presence and integrity of the EVs isolated from both MKN45 WT and SC cell lines. In addition, western blotting results showed the presence of the specific EV markers HSP70, synthenin-1, actin, Alix, CD9 and CD81 in MKN45 WT and SC derived EVs. Curiously, an enrichment of STn antigen was found in SC EVs when compared to the parental cells. NTA results revealed that MKN45 SC cells secreted more EVs than the MKN45 WT cell line. Additionally, an increased migration capacity of the MKN45 SC cell line was observed when comparing with the MKN45 WT cell line. Interestingly, when coculturing the MKN45 WT cells with STn positive EVs an increase in the migration capacity of these cells was observed when compared with the untreated cells. This project was important to demonstrate that STn positive EVs, secreted from cells with high expression of this truncated O-glycan, could effectively modulate the migration capacity of recipient cells. In the future, it will be interesting to explore the impact of STn positive EVs on tumor growth, invasion and metastasis. It will be important to find which mechanisms are regulating the acquired aggressive phenotype caused by STn positive EVs. These results would be crucial for the better understanding of the impact of EV glycosylation, namely the truncated O-glycans, in cancer communication and may bring numerous benefits to the clinical outcome of gastric cancer patients.
As células tumorais adquirem estruturas de glicosilação aberrantes à sua superfície. Uma das modificações de glicanos mais abundante e presente em tecidos de cancro gástrico, é o aumento da expressão de O-glicanos truncados, como o sialil-Tn (STn), que estão associados a uma baixa sobrevivência dos pacientes. De realçar que, alguns dos glicanos associados ao tumor foram já identificados em vesículas extracelulares (VEs). Resultados importantes do nosso grupo demonstraram também o efeito do truncamento prematuro dos O-glicanos (O-glicanos truncados) na modulação do comportamento fenotípico agressivo das células. O objetivo geral deste projeto foi explorar o impacto das VEs positivas para STn na comunicação em cancro, nomeadamente na modulação da capacidade de migração das células recipientes. Foi hipotetizado que as VEs libertadas pelas células cancerígenas com características mais agressivas poderiam influenciar o comportamento fenotípico das células recipientes, nomeadamente a sua capacidade de migração. Neste projeto, usámos uma linha celular de cancro gástrico geneticamente modificada, MKN45 SimpleCell (SC), que sobre-expressa homogeneamente os O-glicanos truncados Tn e STn, e a versão original deste modelo, a MKN45 WT. Para alcançar este objetivo, primeiro foi necessário otimizar as melhores condições de cultura celular e o protocolo apropriado de isolamento das VEs. Estudámos os efeitos da remoção do soro fetal bovino (SFB) do meio de cultura por 48h e 72h na viabilidade celular e na taxa de proliferação das células. Para além disso, avaliámos o impacto do uso de um passo de concentração de meio durante o protocolo de isolamento das VEs. As VEs foram depois caraterizadas por microscopia eletrónica de transmissão (MET) e pela análise da concentração e tamanho das nanopartículas (NTA). A presença de um painel de marcadores conhecidos de VEs, bem como a presença do O-glicano truncado STn, foram avaliadas por “western blotting”. Por último, o papel das VEs positivas para STn na modulação da capacidade de migração das células recipientes foi também avaliado. Os resultados demonstraram que a remoção do SFB do meio de cultura por 48h e 72h não afetou a viabilidade de ambas as células MKN45 WT e SC. Assim, optámos por colher as VEs após o crescimento das células por 72h em meio sem SFB. Para além disso, um melhor rendimento de VEs foi alcançado ao isolar as VEs sem o passo de concentração de meio em comparação com o protocolo com este passo adicional. As imagens de MET mostraram a presença e integridade das VEs isoladas de ambas as linhas celulares MKN45 WT e SC. De seguida, os resultados de “western blotting” revelaram a presença de marcadores específicos de VEs, tais como HSP70, sintenina-1, actina, Alix, CD9 e CD81 em VEs derivadas de MKN45 WT e SC. Curiosamente, um enriquecimento do antigénio STn foi encontrado nas VEs SC quando comparado com as células parentais. Os resultados de NTA revelaram que as células MKN45 SC secretaram mais VEs do que a linha celular MKN45 WT. Adicionalmente, foi observado um aumento na capacidade de migração da linha celular MKN45 SC quando comparada com a linha celular MKN45 WT. De realçar que, ao cultivar as células MKN45 WT juntamente com VEs positivas para STn, um aumento na capacidade de migração dessas células foi observado quando comparado com as células não tratadas. Este projeto foi importante para demonstrar que VEs positivas para STn, secretadas de células com elevada expressão deste O-glicano truncado, poderiam modular efetivamente a capacidade de migração das células recipientes. No futuro, seria interessante explorar o impacto das VEs positivas para STn no crescimento tumoral, invasão e metástase. Será também importante perceber quais os mecanismos que estão a regular a aquisição do fenótipo agressivo causado pelas VEs positivas para STn. Estes resultados seriam cruciais para uma melhor compreensão do impacto da glicosilação das VEs, nomeadamente dos O-glicanos truncados, na comunicação em cancro e poderão trazer inúmeros benefícios para o desfecho clínico dos pacientes com cancro gástrico.
URI: http://hdl.handle.net/10773/30709
Appears in Collections:UA - Dissertações de mestrado
DQ - Dissertações de mestrado

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