Fabrication of a yeast microcapsule platform for bone tissue regeneration

Abstract

Bone is considered a mechanical support system of the human body, which imparts protection for internal organs, being also a reservoir of minerals. During life, bone tissue remains in constant remodelling and has the capacity to regenerate small lesions. Nevertheless, in situations of critical bone fractures and/or chronic diseases, endogenous bone regeneration is limited and generally results in non-union of the fracture fragments and in loss of tissue function. Bearing in mind that the improvement in life-expectancy is accompanied with a higher incidence of bone defects, it is urgent the development of biomaterials, which can deliver proosteogenic drugs or be able to instruct the differentiation of adult stem cells into progenitor bone cells. Given this, hydrogels have been increasingly explored as a tridimensional (3D) platform for support and delivery of stem cells to bone tissues, due to their permeability and similarities to the extracellular matrix (ECM). However, as a result of their high permeability, hydrogels have a low capacity for drug delivery. Yeast microcapsules (YMCAPs) have been mentioned as alternatives with the potential to encapsulate, transport and deliver therapeutic agents in a specific and localized manner. These microcapsules can be obtained through the reuse of spent yeasts discarded as a by-product of brewing industry. In this dissertation, it was aimed to obtain YMCAPs from the brewer’s spent yeast Saccharomyces pastorianus and promote their inclusion into a 3D hydrogel, through a photocrosslinking process. For that, the yeast’s cell wall was isolated through thermal autolysis, obtaining YMCAP_Aut (diameter: 3 - 7.5 µm; zeta potential: -13.9 mV) composed of 38 % of proteins and 41 % of carbohydrates (essentially, mannans and β-glucans). The β-glucans present in YMCAPs_Aut are constituted by glucose residues with (1→4), (1→3) and (1→6) linkages in a proportion of 50.2, 13.5 and 2.5 mol %, respectively. The (1→4) linkages are divided in (α1→4) and (β1→4). The mannans present in YMCAPs_Aut are constituted by mannose residues with (1→2), (1→3) and (1→6) linkages in a proportion of 3, 1.4 and 0.2 mol %, respectively. Through alkaline extraction using 4M KOH, the mannoproteins were solubilized and β-glucans were exposed in the microcapsule surface, obtaining YMCAPs_4M (diameter: 3 - 7.5 µm; zeta potential: 0.25 mV) composed of 34 % proteins and 54 % carbohydrates (essentially, β-glucans). The β-glucans present in YMCAPs_4M are constituted by glucose residues with (1→4), (1→3) and (1→6) linkages in a proportion of 52.8, 20.0 and 2.7 mol %, respectively. The (1→4) linkages are also divided in (α1→4) and (β1→4). YMCAPs were subsequently used for the development of a photocrosslinkable multi-YMCAPs platform. For this, YMCAPs were chemically modified with methacrylate groups or with norbornene groups. With a chemically modified surface, YMCAPs were covalently crosslinked to methacrylated gelatin (GelMA), forming a 3D multi-YMCAPs/GelMA platform with YMCAPs acting as structural/functional units, and with gelatin acting as a 3D structure for cell adhesion. Glycosidic analysis and FTIR and NMR spectroscopic confirmed the successful synthesis of functionalized YMCAPs with the different chemical groups. After, the fabricated hybrid hydrogel was applied to human adipose stem cells (hASCs) encapsulation. In vitro viability studies revealed the biocompatibility of YMCAPs when directly administered or included within the 3D matrix containing stem cells. Moreover, the potential of this hybrid hydrogel/YMCAPs platform to act as drug delivery system was explored. YMCAPs demonstrated to be an effective vehicle for hydrophobic drugs encapsulation, as observed with the use of a fluorescent molecule (e.g., Nile red) and with the use of carvacrol, antiosteoclastogenic monoterpenoid, as a medium of encapsulation of dexamethasone. Overall, the results highlight the possible use of these hybrid platform as a delivery system of stem cells and bioinstructive molecules for bone regeneration application.

O osso é o sistema de suporte mecânico do corpo humano, constituindo também uma proteção dos órgãos internos e um reservatório de minerais. Durante a vida, o tecido ósseo permanece em constante remodelação e tem capacidade de regenerar pequenas lesões. No entanto, em situações de fraturas ósseas críticas e/ou doenças crónicas, a regeneração óssea endógena é bastante limitada, resultando geralmente na não-união dos fragmentos ósseos, e na perda da função tecidular. Tendo em conta que o aumento da esperança média de vida, é acompanhado por um aumento da incidência de defeitos ósseos, torna-se urgente o desenvolvimento de biomateriais que possam entregar fármacos pró-osteogénicos, ou que tenham a capacidade de instruir a diferenciação de células estaminais adultas em células progenitoras do osso. Neste sentido, os hidrogéis têm sido cada vez mais explorados como plataforma tri-dimensional (3D) para suporte e entrega de células estaminais nos tecidos ósseos, devido à sua permeabilidade e semelhanças com a matriz extracelular (ECM). No entanto, devido à sua elevada permeabilidade, os hidrogéis apresentam uma fraca capacidade para entrega de fármacos. As microcápsulas de leveduras (YMCAPs) têm sido mencionadas como alternativas com potencial para encapsular, transportar e entregar agentes terapêuticos de uma forma específica e localizada. Estas microcápsulas podem ser obtidas através da reutilização das leveduras descartadas pela indústria cervejeira. Nesta dissertação, pretende-se obter YMCAPs a partir da levedura excedentária Saccharomyces pastorianus e promover a sua inclusão num hidrogel 3D através de um processo de fotoreticulação. Para isso, a parede celular da levedura foi isolada por autólise térmica, obtendo-se YMCAPs_Aut (diâmetro: 3 - 7.5 µm; potencial zeta: -13.9 mV) compostas por 38 % de proteínas e 41 % de carboidratos (essencialmente mananas e β-glucanas). Nas YMCAPs_Aut, as β-glucanas são constituídas por resíduos de glucose em ligação (1→4), (1→3) e (1→6), na proporção de 50.2, 13.5 e 2.5 mol %, respetivamente. As ligações (1→4) estão divididas em (α1→4) e (β1→4). As mananas presentes nas YMCAPs_Aut são constituídas por resíduos de manose em ligação (1→2), (1→3) e (1→6), na proporção de 3, 1.4 e 0.2 mol %, respetivamente. Por extração alcalina com KOH 4M, as manoproteínas foram solubilizadas, expondo as β-glucanas na superfície da microcápsula, obtendo-se YMCAPs_4M (diâmetro: 3 - 7.5 µm; potencial zeta: 0.25 mV) compostas por 34 % de proteínas e 54 % de carboidratos (essencialmente β-glucanas). Nas YMCAPs_4M, as β-glucanas são constituídas por resíduos de glucose em ligação (1→4), (1→3) e (1→6), na proporção de 52.8, 20.0 e 2.7 mol %, respetivamente. As ligações (1→4) estão também divididas em (α1→4) e (β1→4). As YMCAPs foram posteriormente utilizadas para o desenvolvimento de uma plataforma fotoreticulável. Para isso, as YMCAPs foram modificadas quimicamente com grupos metacrilato ou com grupos norborneno. Com uma superfície quimicamente modificada, as YMCAPs foram covalentemente reticuladas com gelatina-metacrilada (GelMA), formando uma plataforma 3D multi-YMCAPs/GelMA, onde as YMCAPs atuam como unidades estruturais/funcionais, e a gelatina como estrutura 3D para adesão celular. A análise das ligações glicosídicas e espetroscopia de FTIR e RMN confirmou a síntese de YMCAPs funcionalizadas com os diferentes grupos químicos. O hidrogel híbrido fabricado foi posteriormente aplicado para a encapsulação de células estaminais humanas derivadas do tecido adiposo (hASCs). Estudos de viabilidade celular in vitro revelaram a biocompatibilidade das YMCAPs quando administradas diretamente ou incluídas dentro da matriz 3D contendo células estaminais. Adicionalmente, o potencial desta plataforma híbrida hidrogel/cápsulas funcionar como um sistema de libertação de fármacos foi explorado. As YMCAPs demonstraram ser um veículo eficaz para a encapsulação de fármacos hidrofóbicos, conforme observado utilizando uma molécula fluorescente (i.e., vermelho de nilo) e com o uso de carvacrol, monoterpenóide antiosteoclastogénico, como meio de encapsulação da dexametasona. Os resultados obtidos evidenciam a possível utilização destas plataformas híbridas como um sistema de entrega de células estaminais e moléculas bioinstrutivas para aplicação na regeneração óssea.