Porous calcium phosphate bone graft scaffolds for advanced therapies

Abstract

The main aim of this thesis was to develop multifunctional porous calcium phosphate (CaP) based scaffolds as bone grafts for advanced therapies. Undoped and doped (Sr2+, Mg2+ and/or Zn2+) biphasic calcium phosphate (BCP) scaffolds were obtained through a hydrothermal treatment (HT) of cuttlefish bone (CB). The unique microstructure of CB was preserved after HT and its complete transformation was confirmed by X-ray diffraction (XRD). The presence of the doping elements on BCP scaffolds was observed through the shifts of XRD patterns to different angles and the differences of phase quantification were obtained by Rietveld refinement. Nevertheless, inductively couple plasma spectroscopy revealed that the incorporated amounts of the doping elements were significantly lower than the planned ones. The live/dead staining results of human mesenchymal stem cells cultured in vitro in the presence of different scaffolds indicated that cells maintain their viability for 72 h. The presence of doping elements (Sr2+, Mg2+ and Zn2+) improved cell proliferation as observed by MTT assay. As an alternative approach to calcium partial replacement in the crystalline lattices of BCP, the doping elements were incorporated as sol-gel derived bioactive glass (BG) surface coating. This coating improved the mechanical properties of the scaffolds and their in vitro biomineralization activity when immersed in simulated body fluid (SBF). Despite the apparent advantages of this coating, preliminary MTT assay results indicated some pH-induced toxicity associated with ionic leaching from the coating. To overcome the major drawbacks of BCP scaffolds obtained from CB (brittleness and low fracture toughness), polymeric coatings were applied onto their surfaces. With this purpose, two commercial polymers, poly(εcaprolactone) (PCL) and poly(DL-lactide) (PDLA), and two other polymers synthesized in the laboratory, poly(ester amide) (PEA) and poly(ester urea) (PEU) were used. The polymeric coatings enhanced the overall mechanical properties, without compromising the interconnected porous structure, as observed by scanning electron microscopy. Higher values of compressive strength were registered for scaffolds coated with PEU. The presence of the polymers was further confirmed by FTIR. The preliminary in vitro cell culture results performed with polymer coated BCP scaffolds doped by calcium partial substitution with Sr2+, Mg2+ and Zn2+ showed a greater cell proliferation for those coated with PEU. The synergetic effect between CaP and polymers were explored to release rifampicin (RFP) as a model antibiotic, conferring to the scaffolds sustained drug delivery capabilities. The presence of the drug was confirmed by the colour change from white to orange and by the drug release studies. The polymers influence differently the drug release profiles. The release kinetics were faster for the scaffolds coated with PCL in comparison to the samples coated with PEA or PEU. The RFP loaded samples demonstrated to have a strong antibacterial activity against both Gram-negative Escherichia coli and Gram-positive Staphylococcus aureus. In conclusion, we successfully obtain undoped and doped BCP scaffolds derived from CB. The combination of these scaffolds with PCL, PDLA, PEA or PEU improved the mechanical properties and enabled a sustained drug release. These scaffolds can potentially be used as bone graft substitutes to improve bone regeneration and prevent bacterial biofilm formation.

Esta tese teve como principal objetivo o desenvolvimento de scaffolds multifuncionais à base de fosfatos de cálcio (CaP) para substitutos ósseos. As scaffolds bifásicas de fosfatos de cálcio (BCP) não dopadas e dopadas (Sr2+, Mg2+ e/ou Zn2+) foram obtidas através do tratamento hidrotermal (HT) do osso de choco (CB). A microestrutura única do CB foi preservada após a HT e a sua completa transformação foi confirmada por difração de raios-X (XRD). A presença dos elementos dopantes nas scaffolds de BCP foi observada através da deslocação dos padrões de XRD para diferentes ângulos e as diferenças na quantificação de fases for obtida por refinamento de Rietveld. No entanto, a espectrometria de emissão atómica com fonte de plasma mostrou que a quantidade de iões dopantes era significativamente inferior à planeada. A coloração live/dead das células mesenquimais humanas que estiveram na presença das diferentes scaffolds indicaram que as células mantiveram a sua viabilidade durante as 72 h. Através do ensaio com MTT observou-se que a presença dos iões dopantes (Sr2+, Mg2+ e Zn2+) melhorou a proliferação celular. Numa abordagem alternativa à substituição parcial do cálcio na estrutura cristalina do BCP, os iões dopantes foram introduzidos através de um revestimento de superfície com vidro bioativo obtido por sol-gel. Este revestimento melhorou as propriedades mecânicas das scaffolds e também a atividade de bio mineralização in vitro quando imerso em fluido corporal simulado (SBF). Apesar das vantagens deste revestimento, os ensaios preliminares de MTT demonstraram alguma toxicidade induzida pelo pH elevado associado à lixiviação iónica do revestimento. De forma a ultrapassar a principal desvantagem das scaffolds BCP obtidas através de CB (fragilidade e baixa tenacidade à fratura) foram feitos revestimentos poliméricos nas superfícies das scaffolds. Com esse objetivo, dois polímeros comerciais, poli(e-caprolactona) (PCL) e poli(DL-láctico) (PDLA), e dois outros polímeros sintetizados em laboratório, poli(éster amida) (PEA) e poli(éster ureia) (PEU). Os revestimentos poliméricos melhoraram as propriedades mecânicas sem comprometer a estrutura porosa interconecta, tal como observado por microscopia eletrónica de varrimento. As scaffolds revestidas com PEU registaram os valores mais altos de resistência à compressão. A presença dos polímeros foi ainda confirmada por FTIR. Os resultados preliminares dos ensaios de cultura celular in vitro realizados com scaffolds dopadas por substituição parcial de cálcio por Sr2+, Mg2+ e Zn2+ mostraram uma maior proliferação celular para aquelas revestidas com PEU. O efeito sinergético entre CaP e polímeros foi explorado para permitir a libertação de rifampicina (RFP) como um antibiótico modelo, conferindo às scaffolds a capacidade de libertação controlada de fármaco. A presença do fármaco foi confirmada pela alteração de cor de branco para cor-de-laranja e pelos estudos de libertação do fármaco. Os polímeros influenciam diferentemente os perfis de libertação do fármaco. A cinética de libertação foi mais rápida nas scaffolds revestidas com PCL em comparação com as amostras revestidas com PEA ou PEU. As amostras com RFP demonstraram ter uma forte atividade antibacteriana contra Gram-negativa Escherichia coli e Gram-positiva Staphylococcus aureus. Em conclusão, obtivemos com sucesso scaffolds BCP não dopadas e dopadas derivadas de CB. A combinação destas scaffolds com PCL, PDLA, PEA e PEU melhorou as propriedades mecânicas e permitiu uma libertação controlada do fármaco. Estas scaffolds podem ser potencialmente utilizadas como substitutos ósseos para melhorar a regeneração óssea e impedir a formação de um biofilme bacteriano.