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Title: Stabilization and valorisation of broccoli byproducts as ingredients, source of bioactive compounds, and biomaterials
Other Titles: Estabilização e valorização de subprodutos de brócolo como ingredientes, fonte de compostos bioativos e biomateriais
Author: Ferreira, Sónia dos Santos
Advisor: Coimbra, Manuel António
Cardoso, Susana Maria de Almeida
Wessel, Dulcineia Maria de Sousa Ferreira
Keywords: Broccoli by-products
Phenolic compounds
Immunostimulatory activity
Films with broccoli
Defense Date: 26-Nov-2020
Abstract: Losses in the frozen-food industry of broccoli can account for more than 45% of the raw material, resulting in a large amount of by-products with low economic value and of considerable environmental impact. The main byproducts are stalks, inflorescence remains and leaves, sharing broccoli nutritional value and bioactive compounds such as glucosinolates, phenolics, pigments, and polysaccharides (as dietary fibre). However, their high amount of water (around 90%) and consequent perishability limit by-products valorisation. In this regard, broccoli by-products, if adequately stabilized to preserve the characteristics of the bioactive compounds, can be a source of food ingredients and biomaterials to be used in biobased packaging. To stabilize broccoli by-products, microwave hydrodiffusion and gravity (MHG) was used to dehydrate and simultaneously recover the water-soluble diffused compounds for incorporation as food ingredients. The hydrodiffusion allowed to obtain a dried material with 12% moisture in 43 min when 550 g of broccoli by-products were used, preserving polysaccharides and proteins. Diffused water contained up to 317 µg/mL gallic acid equivalents of phenolic compounds, 11 mg/mL free sugars, 9 mg/mL amino acids, and 356 µg/mL glucosinolates, depending on the type of by-product used. The simultaneous stabilization by dehydration and extraction of bioactive compounds showed the potential of MHG technology for valorisation of broccoli by-products. Blanching pre-treatment has been reported to improve the drying rate of broccoli, promoting simultaneous enzyme inactivation. Therefore, the impact of pre-dehydration blanching step, freeze-drying, air-drying, and MHG dehydration on the levels of pigments, glucosinolates, and phenolics, was studied by UHPLCDAD-ESI/MSn . When compared to freeze-drying, a technique known to preserve compounds, a pre-blanching step increased the extractability of both pigments and phenolics, while air-drying only retained 49% of the pigments and 70% of phenolics, both without affecting glucosinolates. However, when air-drying was preceded by blanching, less than 50% of compounds were retained. On the other hand, MHG dehydration increased the phenolics extractability by 26%, particularly that of kaempferol derivatives while also retaining the amount of the glucosinolate glucoraphanin, when compared to freeze-drying. Nevertheless, only 23% of indole glucosinolates were recovered and pigments were severely reduced, with lutein accounting only for 32% and only chlorophyll b was observed in trace amounts after MHG dehydration. Therefore, to valorise broccoli byproducts as ingredients, different drying technologies may be used when targeting different composition richness: freeze-drying is suitable for pigments and glucosinolates, air-drying is suitable for glucosinolates, while MHG promotes the extractability of phenolic compounds. As there is scarce information about broccoli polysaccharide bioactivities, pectic polysaccharides were extracted, fractionated, and characterized and their immunostimulatory activity was evaluated by in vitro incubation with BALB/c splenocytes and flow cytometry. Polysaccharides were further fractionated by size and charge, enzymatically treated, and chemically sulfated to establish structure-function relationships of pectic polysaccharides with B lymphocytes activation. Pectic polysaccharides obtained after preparation of alcohol insoluble residue (AIR, stabilized by solvent drying), hot water extraction, and 80% ethanol precipitation (Et80) stimulated B lymphocytes. In contrast, pectic polysaccharides extracted with imidazole, Na2CO3, and KOH solutions did not stimulate B lymphocytes. Et80 fraction had methyl- and acetyl-esterified pectic polysaccharides, 4-linked galactans, arabinans, and type II arabinogalactans with 4-O-Me-GlcA residues, as well as α-glucans. Fractionation of Et80 polysaccharides by molecular weight (from 12 to 400 kDa) showed that all fractions had immunostimulatory activity. Removal of terminal Ara or small chains of Ara also did not change immunostimulatory activity. However, the methyl deesterification of pectic polysaccharides and removal of galacturonan regions reduced polysaccharides immunostimulatory activity. Fractionation of these polysaccharides allowed to obtain an acidic fraction with immunostimulatory activity, indicating that neutral polysaccharides were masking the immunostimulatory activity of the acidic ones. Chemical sulfation also reduced activity, probably hiding structural features important for B cells activation. These results show that broccoli by-products can be valorised as a source of pectic polysaccharides to serve as functional food ingredients to improve immune function and promote health. Taking the opportunity to contribute to reduce the environmental issues of petroleum-based plastics by developing starch-based renewable and biodegradable materials, broccoli by-products were used to evaluate their impact on mechanical properties and surface hydrophilicity of the films. Addition of byproducts before starch gelatinization and filtration steps allowed to obtain films with higher strength, stiffness, and elasticity than starch control film. Moreover, less hydrophilic surfaces were obtained with addition of broccoli by-products. Antioxidant activity, water content, and water solubility were maintained with addition of broccoli by-products. Water extractable compounds were the main contributors to the observed mechanical properties changes. Even higher elasticity was obtained when genipin was added. After one-year storage, films tended to be more strength, less flexible, stiffer, and with increased hydrophobicity of surfaces, indicating that broccoli by-products addition promoted starch matrix rearrangements along storage. These promising results of incorporation of broccoli by-products in starch films show the valorisation potential of broccoli by-products by application as bioplastics on the packaging field. In conclusion, broccoli by-products can be stabilized after simultaneous dehydration and extraction of bioactive compounds that can be valorised as food ingredients and as additives in the packaging field, contributing to a circular economy and reduction of industrial wastes.
Na indústria de congelação de brócolo, as perdas podem ultrapassar mais de 45% da matéria-prima, resultando numa grande quantidade de subprodutos com baixo valor económico e impacto ambiental considerável. Os principais subprodutos são caules, folhas e restos de inflorescências, partilhando o valor nutricional e os compostos bioativos dos brócolos, como glucosinolatos, fenólicos, pigmentos e polissacarídeos (como fibra alimentar). No entanto, a elevada quantidade de água (cerca de 90%) e consequente perecibilidade limitam a valorização destes subprodutos. Neste sentido, os subprodutos de brócolo, quando adequadamente estabilizados para preservar os compostos bioativos, podem ser uma fonte de ingredientes alimentares e biomateriais para serem utilizados em embalagens de base biológica. Para estabilizar os subprodutos de brócolo, a tecnologia de microondas por hidrodifusão e gravidade (MHG) foi usada para desidratar e recuperar simultaneamente os compostos solúveis em água para incorporação como ingredientes alimentares. A hidrodifusão permitiu obter um material seco com 12% de humidade em 43 min, quando foram utilizados 550 g de subprodutos de brócolo, preservando os polissacarídeos e a proteína. A água recuperada por hidrodifusão continha até 317 µg/mL de compostos fenólicos como equivalentes de ácido gálico, 11 mg/mL de açúcares livres, 9 mg/mL de aminoácidos e 356 µg/mL de glucosinolatos, dependendo do tipo de subproduto utilizado. A estabilização por desidratação e simultânea extração de compostos bioativos mostrou o potencial da tecnologia MHG para valorização de subprodutos de brócolo. O branqueamento como pré-tratamento tem sido usado para melhorar a taxa de secagem dos brócolos, promovendo simultaneamente a inativação das enzimas. Atendendo a esta informação, o impacto do branqueamento antes da desidratação por liofilização, por convecção de ar e assistida por MHG nos níveis de pigmentos, glucosinolatos e fenólicos foi estudada por UHPLC-DADESI/MSn . Quando comparada à liofilização, uma técnica conhecida por preservar compostos, o branqueamento aumentou a capacidade de extração de pigmentos e fenólicos, enquanto a secagem por convecção de ar reteve apenas 49% dos pigmentos e 70% de fenólicos, ambos os tratamentos sem afetar os glucosinolatos. No entanto, quando a secagem por convecção de ar foi precedida de branqueamento, menos de 50% dos compostos foram retidos. Por outro lado, a desidratação por MHG aumentou a capacidade de extração de fenólicos em 26%, particularmente a dos derivados de kaempferol, além de reter a quantidade do glucosinolato glucorafanina, quando comparada à liofilização. No entanto, apenas 23% dos glucosinolatos com um grupo indole foram recuperados e os pigmentos foram severamente reduzidos, com a luteína representando apenas 32% e apenas a clorofila b foi observada em pequenas quantidades após a desidratação por MHG. Portanto, para valorizar os subprodutos de brócolo, diferentes tecnologias de secagem podem ser usadas para se obter ingredientes com composição variada: a liofilização é adequada para pigmentos e glucosinolatos, a secagem por convecção de ar é adequada para glucosinolatos, enquanto a tecnologia de MHG promove a extração de compostos fenólicos. Como existem poucas informações sobre a bioatividade dos polissacarídeos de brócolo, os polissacarídeos pécticos foram extraídos, fracionados e caracterizados, e a sua atividade imunoestimuladora foi avaliada por incubação in vitro com BALB/c splenócitos e citometria de fluxo. Os polissacarídeos foram posteriormente fracionados por tamanho e carga, tratados enzimaticamente e sulfatados quimicamente para estabelecer relações estrutura-função dos polissacarídeos pécticos com ativação dos linfócitos B. Polissacarídeos pécticos obtidos após a preparação de resíduo insolúvel em álcool (AIR, estabilizado por secagem com solvente), extração com água quente e precipitação com etanol a 80% (Et80) estimularam os linfócitos B. Por outro lado, os polissacarídeos pécticos extraídos com soluções de imidazol, Na2CO3 e KOH não estimularam os linfócitos B. A fração Et80 possuía polissacarídeos pécticos esterificados com grupos metilo e acetilo, galactanas em ligação 1-4, arabinanas e arabinogalactanas tipo II com resíduos de 4-O-Me-GlcA. O fracionamento dos polissacarídeos Et80 por peso molecular (de 12 a 400 kDa) mostrou que todas as frações apresentavam atividade imunoestimuladora. A remoção da Ara terminal ou pequenas cadeias de Ara também não alterou a atividade imunoestimuladora. No entanto, a desesterificação dos grupos metilo e remoção das regiões de homogalacturonanas dos polissacarídeos pécticos reduziram a atividade imunoestimuladora. O fracionamento desses polissacarídeos permitiu obter uma fração acídica com atividade imunoestimuladora, indicando que a atividade destes polissacarídeos acídicos era ocultada pela presença de polissacarídeos neutros. A sulfatação química também reduziu a atividade, provavelmente por obstruir as características estruturais importantes para a ativação das células B. Estes resultados mostram que os subprodutos de brócolo podem ser valorizados como fonte de polissacarídeos pécticos para ingredientes funcionais que melhorem a função imunológica e promovam a saúde. Com a preocupação de reduzir as questões ambientais dos plásticos à base de petróleo, desenvolveram-se materiais renováveis e biodegradáveis à base de amido com inclusão de subprodutos de brócolo e foi avaliado o impacto da sua adição nas propriedades mecânicas e na hidrofilicidade da superfície dos filmes. A adição de subprodutos antes das etapas de gelatinização e filtração do amido permitiu obter filmes com maior resistência, rigidez e elasticidade do que o filme de amido controlo. Além disso, superfícies menos hidrofílicas foram obtidas com a adição de subprodutos de brócolo. A atividade antioxidante, o teor de água e a solubilidade em água foram mantidos com a adição destes subprodutos. Os compostos extractáveis com água foram os principais contribuintes para as alterações observadas nas propriedades mecânicas. Uma elasticidade ainda maior foi obtida quando a genipina, um reticulante natural, foi adicionada. Após um ano de armazenamento, os filmes tenderam a ser mais resistentes, menos flexíveis, mais rígidos e com superfícies mais hidrofóbicas, indicando que a adição de subprodutos de brócolo promoveu rearranjos da matriz de amido ao longo do armazenamento. Estes resultados promissores da incorporação de subprodutos de brócolo nos filmes de amido mostram o potencial de valorização dos subprodutos de brócolo para aplicação em bioplásticos para embalagens. Em conclusão, os subprodutos de brócolo podem ser estabilizados após desidratação e extração simultâneas de compostos bioativos que podem ser valorizados como ingredientes alimentares e como aditivos na área de embalagens, contribuindo para a redução de resíduos industriais e uma economia circular.
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