New tools based on mass spectrometry approaches for the identification of nitrated complex lipids

Abstract

Over the last years, the interest in products resulting from endogenous nitration reactions has increased, namely in nitro-fatty acids (NO2-FAs) that are considered as important signaling molecules. Although NO2-FA were detected in vivo as free species or adducted to proteins, esterified forms were only recently reported as nitrated phospholipid (NO2-PLs) and nitrated triacylglycerides (NO2-FA-TAG), together with the occurrence of lipoxidation adducts of NO2-PLs. The free, esterified and nucleophilic-adducted NO2-FA, generated in in vitro mimetic systems and in vivo, were detected using mass spectrometry (MS)-based approaches, coupled or not to liquid chromatography, with the identification of their typical fragmentation pattern and characteristic reporter ions under tandem MS (MS/MS) conditions. However, recent studies on the structural characterization of NO2-PLs allowed to suggest that both the information can vary depending on the type of mass spectrometer and the dissociation technique used to induce the fragmentation. This is a key issue since it can hinder the identification of these nitrated and nitroxidized derivatives in biological samples. Thus, an understanding of what analytical parameters are best to obtain the most useful information is a key issue for the identification of these modified PLs species. In this way, the aims of this work are (a) the identification of typical fragmentation patterns using different MS instrumental platforms to improve the accurate detection of the nitrated and nitroxidized derivatives of complex lipids obtained from in vitro biomimetic models systems, and (b) the development of lipidomic strategies to improve their identification in complex biological samples using the optimized high-throughput MS-based methodologies. To accomplish our goal, we first evaluate the influence of the normalized collision energy (NCE), under higher-energy collisional dissociation (HCD)- MS/MS conditions in Q-Exactive Orbitrap, in the fragmentation pattern to identify the most suitable acquisition conditions and reporter ions to detect nitrated PLs. This will contribute to identify and quantify these species in biological samples. Nitrated and nitroxidized PLs species were synthesized through an in vitro mimetic system of nitration with nitronium tetrafluoroborate (NO2BF4), which was used to nitrate phosphatidylcholine (PC) and phosphatidylethanolamine (PE) standards. The results showed that the intensity of the typical NL of nitrous acid (HNO2, 47 Da) diminishes with increasing NCE, becoming non-detectable for a higher NCE. However, fragment ions corresponding to the carboxylate anions of the modified fatty acyl chain were identified as potential reporter ions to detect nitrated PLs when using the HCD-MS/MS in lipidomics analysis. This methodology was applied in the analysis of cell lipid extracts treated with nitrated PC, which allowed the detection of NO2-PC and the validation of the developed methodology. The results obtained in this chapter revealed that the relative abundance of reporter ions of nitrated and nitroxidized PLs is significantly affected by the NCE applied. which in fact determines what fragment ions are observed, being a key factor for the successful of the detection of these nitrated PLs in biological samples. As the fragmentation fingerprinting of nitrated PLs obtained under HCDMS/MS conditions revealed to be dissimilar to the one previously reported under collision-induced dissociation (CID)-MS/MS, we evaluated the potential differences on the relative abundance of the typical reporter ions and fragmentation pattern of nitroso and nitro derivatives of different classes of PLs. These species were generated in vitro and their characterization was performed using MS/MS approaches based on two different ion activation methods: CID in a LXQ-Linear Trap (LIT) and HCD in a Q-Exactive Orbitrap. The results presented in this chapter revealed that the major differences between MS/MS spectra from CID-LXQ-LIT and HCD-Orbitrap are related with different relative abundance, and consequently distinct intensity, of specific reporter ions of nitrated PLs. Nitrated and nitroxidized triacylglycerides generated in vitro were also characterized by HCD-MS/MS in a Q-Exactive Orbitrap. Its fragmentation pattern included the typical NL of HNO2 with a high relative abundance, revealing to be more similar with the fragmentation pattern of nitrated PLs obtained in CID-LXQ-LIT. Overall, the results gathered in this thesis provide new insights into the nitrated and nitroxidized derivatives of esterified NO2-FA in PLs and TAG, and the identification of their fragmentation fingerprinting based on advanced HCDMS and MS/MS approaches. This information can be successfully used for targeted analysis of nitrated and nitroxidized lipids in biological samples, in different circumstances, namely in health and/or in disease conditions contributing to determine the biological properties and in vivo signaling actions of these nitrated molecules.

Nos últimos anos, o interesse em produtos que resultam de reações de nitração a nível endógeno tem crescido, nomeadamente os ácidos gordos nitrados (NO2-FA), os quais têm sido considerados importantes moléculas de sinalização. Os NO2-FA têm sido reportados in vivo, quer na sua forma livre quer na forma de aductos com proteínas, e mais recentemente foram detetados em fosfolípidos (NO2-PLs) e triglicerídeos nitrados (NO2-FA-TAG). Também já foram reportados aductos de NO2-PLs com proteínas. Os NO2-FA livres, esterificados ou na forma de aductos com proteínas têm sido detetados in vitro e in vivo usando abordagens baseadas em espetrometria de massa (MS), com ou sem separação por cromatografia líquida. Estas identificações têm sido possíveis através da deteção do seu padrão de fragmentação típico e pela presença de iões diagnóstico característicos em condições de espetrometria de massa tandem (MS/MS). No entanto, estudos recentes sobre a caracterização estrutural de NO2-PLs sugeriram que estas informações podem variar dependendo do tipo de espectrómetro de massa e da técnica de dissociação utilizada para induzir a sua fragmentação em MS/MS. Esta é uma questão importante, podendo dificultar a identificação destes derivados nitrados e nitroxidados em amostras biológicas. Assim, o conhecimento dos melhores parâmetros para obter a informação mais útil em MS é crucial para a sua identificação. Deste modo, os objetivos deste trabalho são (a) identificar os padrões de fragmentação típicos em MS usando diferentes plataformas instrumentais, de modo a contribuir para uma melhor identificação dos derivados nitrados e nitroxidados de lípidos complexos obtidos a partir de modelos biomiméticos in vitro, e (b) desenvolver estratégias lipidómicas para melhorar a sua identificação em amostras biológicas complexas utilizando as metodologias baseadas em MS/MS. Para alcançarmos os objetivos propostos, avaliamos o efeito da energia de colisão (NCE) em condições de MS/MS, utilizando dissociação induzida por colisão de alta energia (HCD) numa Q-Exactive Orbitrap, no padrão de fragmentação para identificar as condições de aquisição e os iões diagnóstico que melhor permitem detetar os PLs nitrados e, assim, permitir a sua identificação e quantificação em amostras biológicas. Os fosfolípidos nitratos e nitroxidados foram sintetizados através de um sistema mimético de nitração in vitro com tetrafluoroborato de nitrónio (NO2BF4), que foi usado para nitrar moléculas padrão de fosfatidilcolina (PC) e fosfatidiletanolamine (PE). Os resultados obtidos mostraram que a intensidade da perda neutra (NL) característica de ácido nitroso (HNO2, 47 Da) diminui com o aumento da NCE, tornando-se indetetável com uma NCE mais elevada. Contudo, os iões fragmento correspondentes aos aniões carboxilato dos ácidos gordos modificados, observados em espectros de MS/MS adquiridos na QExactive Orbitrap, foram identificados como potenciais iões diagnóstico que permitem identificar fosfolípidos nitrados através de uma análise lipidómica por HCD-MS/MS. Esta metodologia foi aplicada na análise de extratos lipídicos de células co-cultivadas com PC nitrada, para a validação dos resultados obtidos na caracterização de NO2-PL em modelos biomiméticos. Os resultados obtidos neste capítulo demonstraram que a NCE usada influência significativamente a abundância relativa de iões diagnóstico dos PLs nitrados e nitroxidados determinando, assim, quais os iões fragmento observados sendo por isso um fator chave para o sucesso da identificação destes PLs nitrados em amostras biológicas. Uma vez que o perfil de fragmentação dos PLs nitrados obtido em HCD-MS/MS demonstrou ser diferente do anteriormente reportado para a dissociação induzida por colisão (CID) em espectrómetros de massa do tipo Trapa Linear (LXQ-LIT), avaliamos as potencias diferenças na abundância relativa dos iões diagnóstico característicos e no padrão de fragmentação dos derivados nitroso e nitro de diferentes classes de PLs. Estas espécies foram obtidas após nitração in vitro e a sua caracterização foi realizada por MS/MS utilizando dois métodos diferentes de ativação de iões em MS/MS: CID em LXQ-LIT e HCD em Q-Exactive Orbitrap. Os resultados deste capítulo revelaram que as principais diferenças entre os espectros de MS/MS adquiridos em CID-LXQLIT e HCD-Orbitrap estão relacionadas com uma abundância relativa diferente e, consequentemente, uma intensidade distinta dos iões diagnóstico característicos dos PLs nitrados. Os triglicerídeos nitrados e nitroxidados foram também caracterizados por HCD-MS/MS em Q-Exactive Orbitrap. O seu padrão de fragmentação incluí a presença de iões produto formados pela NL de HNO2 com uma elevada abundância relativa, demonstrando ser semelhante ao padrão de fragmentação dos NO2-PLs obtido em CID-LXQ-LIT. No geral, os resultados obtidos nesta tese fornecem novos conhecimentos sobre a identificação do padrão de fragmentação característico de derivados nitrados e nitroxidados dos NO2-FA esterificados com PLs e TAG utilizando abordagens baseadas em HCD-MS e MS/MS. Esta informação pode ser utilizada com sucesso na análise direcionada de lípidos nitrados e nitroxidados em amostras biológicas, em diferentes contextos, nomeadamente na saúde ou associado a doenças, e assim contribuir para determinar as propriedades biológicas e função sinalizadora in vivo destas moléculas nitradas.