Desenvolvimento de uma metodologia por microextracção em fase sólida e cromatografia em fase gasosa acoplada à espectrometria de massa (SPME/GC-MS) para detecção de Helicobacter pylori através da utilização de amidas alifáticas

Abstract

A Helicobacter pylori é uma bactéria Gram-negativa que coloniza o estômago de cerca de metade da população mundial. Em Portugal a prevalência é de cerca de 80%. Esta bactéria está associada ao desenvolvimento de patologias do foro gástrico, como gastrite, úlcera péptica, carcinoma gástrico e linfoma de MALT. Alguns testes actualmente disponíveis para a detecção da Helicobacter pylori são invasivos e desconfortáveis ou são dispendiosos. Com este trabalho pretendeu-se desenvolver uma metodologia não invasiva com recurso à microextracção em fase sólida acoplada à cromatografia em fase gasosa e à espectrometria de massa (SPME/GC-MS) com vista à detecção da presença da Helicobacter pylori através de amidas alifáticas que, em contacto com a bactéria, são convertidas nos ácidos alifáticos correspondentes. Numa primeira etapa, a metodologia foi optimizada relativamente à fase estacionária, tendo sido estudados três tipos de fibras: Divinilbenzeno/Carboxen/Polidimetilsiloxano (DVB/Car/PDMS), Carbowax/Divinilbenzeno (CW/DVB) e Poliacrilato (PA). A fase estacionária CW/DVB foi a escolhida pois apresenta a maior eficiência extractiva relativamente aos compostos a analisar: o ácido propiónico e o ácido butírico. Foram feitos ensaios experimentais a partir de uma amidase comercial e de culturas da estirpe de Helicobacter pylori J99 obtidas a partir de um isolado clínico de modo a avaliar a formação de ácidos carboxílicos produzidos pelas amidases em presença de amidas alifáticas. Os resultados obtidos indicam que, após adição de propionamida e/ou de butiramida ao meio contendo a bactéria, ocorre a formação dos respectivos ácidos carboxílicos, por acção da amidase bacteriana sobre as amidas adicionadas. Estes ácidos formados são voláteis passando para a fase de vapor em quantidades que permitem a sua detecção e quantificação por GC-MS.

ABSTRACT: The Helicobacter pylori is a Gram-negative bacterium that colonizes the human stomach of half of the world population. In Portugal, the prevalence is around 80%. This bacterium is associated to the development of gastric pathologies such as gastritis, peptic ulcer, gastric carcinoma, and MALT lymphoma. Some currently available tests for the detection of the Helicobacter pylori are uncomfortable, mainly invasive or expensive. A non invasive methodology was developed using a solid phase microextraction and gas chromatography coupled to the mass spectrometry (SPME/GC-MS). Its aim is the detection of the presence of the Helicobacter pylori with aliphatic amides that, when in contact with the bacteria, are converted into the corresponding aliphatic acids. In a first period, the methodology was optimised relatively to the stationary phase. Three types of fibres were studied: Divinylbenzene/Carboxen/Polydimethylsiloxane (DVB/Car/PDMS), Carbowax/Divinylbenzene (CW/DVB), and Polyacrylate (PA). The stationary phase CW/DVB was chosen because it presents higher extractive efficiency in relation to the compounds under analysis: propionic and butyric acids. Experimental studies were done with the commercial enzyme amidase and Helicobacter pylori J99 cultures of “clinical isolated”, as a way to evaluate the formation of carboxylic acids produced by the amidases in presence of aliphaticamides. The results obtained indicate that, after the addition of propionamide and/or butyramide to the environment containing the bacteria, the formation of the respective carboxylic acids occurs by action of the bacterial amidase to the added amides. The acids formed are volatile, migrating to the vapour phase in quantities that permit their detection and quantification by GC-MS.