Biomimetic strategies using layer-by-layer towards biomedical and tissue engineering applications

Abstract

The development of a suitable coating or material, which physico-chemical, mechanical or biological properties, that can be tailored according the features of the target tissue, has been gaining increased importance in biomedical and tissue engineering and regenerative medicine (TERM) fields. Biomimetic strategies have contributed significantly for the progress of biomedical field during the last years. This is possible to be achieved at different levels: imitating Nature form or function and mimicking natural processes and systems are the most used biomimetic approaches. In this thesis, Layer-by-Layer (LbL) methodology was used as a hierarchical biomimetic tool to modify surfaces and to produce freestanding membranes based on polyelectrolyte multilayers (PEMs). The possibility to functionalize or engineer biomaterials combined with the ability to incorporate a wide range of building blocks, makes LbL a powerful processing technique in the biomedical field. Synthetic polymers have been used to construct PEMs for biomedical and TERM applications; however, they lack often on adhesive cues for cell attachment and tissue growth. To overcome such issue, biomimetic synthetic polymers have been developed. Elastin-like polypeptides (ELPs) are a class of nature-inspired polymers, nonimmunogenic, genetically encodable and biocompatible. These materials are based on the repetition of short peptides considered to be building blocks in natural elastin and can include specific bioactive sequences, as the tripeptide Arginine-Glycine-Aspartame (RGD) known by promoting cell adhesion. For the first work of this thesis, ELPs were functionalized with azide and alkyne groups to introduce the reactivity required to carry out the 1,3-dipolar cycloaddition under mild biocompatible conditions, with no toxic by-products and in short reaction times. This reaction was done by means of a LbL assembly, driven by covalent interactions instead of being driven by electrostatic interactions, obtaining a bioactive and biomimetic multilayer coating. Moreover, these polymers are characterized by a critical temperature, known as the transition temperature in aqueous solution (Tt), which is related with a conformational reorganization. Thus, below Tt the polymer chains were soluble in water and above Tt they formed nano- and micro-aggregates becoming insoluble in a reversible process, making these coatings stimuli-responsive. In the following chapters, several polysaccharides as chitosan (CHT), alginate (ALG), hyaluronic acid (HA) or chondroitin sulfate (CS) were used to produce freestanding structured membranes through LbL processes, mainly driven by electrostatic interactions. The use of PEMs containing biopolymers are particularly appealing to coat and develop multilayered structures with biochemical functionalities, biocompatibility, and to mimic the interactions observed in native extracellular matrix (ECM). CHI/CS multilayers were used throughout the thesis, revealing some unique properties, when compared with other polysaccharide-based multilayers, such as their elasticity and degradation rate. However, natural origin polymer-based multilayers present low stiffness and higher hydration rates, which hinder cell adhesion. To overcome this, the CHT/CS multilayers were crosslinked with genipin. This is also a natural product, that is extracted from gardenia fruits and presents the ability to improve the mechanical properties, while preserves the biocompatibility and even enhances the cell adhesive properties. The ability to tailor the multilayers properties can be applied during their assembly or postassembly. Upon adjusting cross-linking parameters (e.g., cross-linker concentration and reaction time) the morphology, thickness, water uptake, rate of biodegradation, mechanical properties and cell adhesive properties can be tuned. Studies of shape-memory of these multilayered films, presented promising results regarding their use in biomedical applications. The mechanical properties of the multilayers can be further improved combining covalent and ionic crosslinking, which gives rise to a full interpenetrating polymer network. More interesting, it was possible to create a well-organized patterned topography at the surface of the freestanding multilayered membrane, just by using a different underlying substrate. This strategy envisaged to mimic the topography of the ECM of some tissues, as bone, skin or nerves, creating grooves on the material’s surface at nanoscale. Using this approach, it was possible to control some cellular functions and behavior as alignment and differentiation. Further in this thesis and inspired by the composition of the adhesive proteins in mussels, freestanding multilayered membranes containing dopamine-modified hyaluronic acid (HA-DN) were produced. The presence of DN along with the thickness of the membranes presented better lap-shear adhesion strength than the control membranes (hyaluronic acid and alginate films – two polysaccharides often regarded as good natural adhesives – were assembled together). Moreover, in vitro tests showed an enhanced cell adhesion for the membranes containing HA-DN and ability to use such kind of membranes for different biomedical and TERM applications, particularly for bone regeneration and skin wound healing. Combining different biomimetic concepts, it was also possible to recreate the complex environment of osteoarthritic articular cartilage by preparing human circular discs of superficially damaged articular cartilage from human samples. Herein, the adhesive freestanding multilayered membranes were used as a vehicle to deliver human adipose stem cells (hASCs) to help to repair the damaged cartilage. hASCs temporarily adhered to the adhesive LbL-based membranes, and were transported to the cartilage discs, creating a bridge of cells between the membranes and the surface of the cartilage. The cells started to migrate into the defects of the cartilage, proliferating and secreting factors capable of repairing the cartilage. Overall, the developed work in this thesis shows that LbL is a very versatile technique that provides the means to develop a wide range of solutions to be useful in biomedical and TERM applications.

O desenvolvimento de um revestimento ou material cujas propriedades físicoquímica, mecânicas ou biológicas podem ser modificadas de acordo com as propriedades do tecido alvo, tem ganho cada vez mais importância, nomeadamente para fins biomédicos e de engenharia de tecidos e medicina regenerativa. Durante os últimos anos, diferentes estratégias biomiméticas têm contribuído significativamente para o progresso destas áreas. Estas são possíveis de implementar a diferentes níveis: imitar formas e funções existentes na natureza ou mimetizar processos e sistemas naturais. Na presente tese, a técnica camada-a-camada (LbL) foi usada como uma ferramenta biomimética para modificar superfícies ou produzir membranas com base em múltiplas camadas de polieletrólitos. A crescente utilização desta técnica, concretamente na área biomédica, prende-se com a possibilidade de funcionalizar ou produzir biomateriais aliada à capacidade de incorporar uma gama alargada de blocos de construção. Aqui, diferentes polímeros sintéticos e naturais têm sido usados para construir estruturas multicamada; no entanto, a generalidade dos polímeros sintéticos não apresenta naturalmente locais de ligação e adesão celular. Para contornar este obstáculo, algumas modificações químicas aos polímeros sintéticos têm sido sugeridas e novos compostos têm sido desenvolvidos, inspirados na composição de sistemas naturais. Por exemplo, polipéptidos tipo-elastina (ELPs) são uma classe de polímeros inspirados na natureza, que apresentam propriedades não-imunogénicas e biocompatíveis, podendo ser geneticamente programados conforme desejado. A sua composição baseia-se na repetição de pequenos péptidos também presentes na elastina humana, com a possibilidade também de incorporar outras sequências bioativas especificas, como o tripéptido Arginina-GlicinaÁcido Aspártico (RGD), reconhecido por promover a adesão celular. Para esta tese foram produzidos ELPs, que mais tarde foram funcionalizados com grupos azida e alquino para introduzir a reatividade necessária para uma reação 1,3-dipolar de ciclo-adição se realizar em condições biocompatíveis, sem produtos tóxicos resultantes e em curtos tempos de reação. Esta reação foi realizada sob a técnica LbL, mas conduzida por interações covalentes ao invés de electroestáticas, para atuar como revestimento biomédico. Estes polímeros são ainda reconhecidos pela sua temperatura de transição (Tt) em solução aquosa, relacionada com uma reorganização conformacional da cadeia polimérica. Abaixo da Tt as suas cadeias poliméricas são solúveis, mas acima de Tt formam-se micro-agregados; este é um processo reversível que confere propriedades responsivas aos revestimentos. Nos seguintes capítulos, diferentes polissacarídeos como quitosano (CHT), alginato (ALG), sulfato de condroitina (CS) ou ácido hialurónico (HA), foram usados para produzir membranas multicamadas conduzidas maioritariamente via interações electroestáticas. Esta abordagem tem ganho cada vez mais importância para desenvolver materiais com funcionalidade bioquímica, biocompatibilidade e para mimetizar algumas interações observadas na matriz extracelular (ECM). Ao longo desta tese foram usadas membranas multicamada de CHT/CS; estes materiais revelaram algumas propriedades muito particulares, quando comparadas com outros sistemas de multicamada, como a sua elasticidade e taxas de degradação mais rápidas. No entanto, a baixa rigidez e maiores taxas de hidratação, que muitas vezes impedem a adesão celular, surgem frequentemente associados a sistemas multicamada compostos somente por polissacarídeos. Para contornar este obstáculo, as membranas multicamada de CHT/CS foram reticuladas com genipina. De notar que este composto é de origem natural, sendo extraído da fruta da gardénia; a pós-modificação das membranas com genipina resultou na melhoria das propriedades mecânicas e biocompatibilidade, e ainda, no aumentando das propriedades bio-adesivas. Na realidade, a possibilidade de modular as propriedades destes sistemas multicamada por reticulação química pode ser conseguida logo durante a adsorção de cada camada ou no fim do processo. Características dos biomateriais como a morfologia, espessura, taxas de adsorção de água ou biodegradação, propriedades mecânicas e biológicas podem ser moduladas ajustando certos parâmetros de reticulação (por exemplo, agente de reticulação, concentração ou tempo de reação). Para além do mais, estudos de memória de forma destas membranas multicamada mostraram resultados promissores, considerando o seu uso para fins biomédicos. As propriedades mecânicas destes sistemas foram melhoradas combinando as ligações electroestáticas já existentes com ligações covalentes conferidas pela reticulação química, dando origem a uma rede polimérica multicamada, mas interpenetrada. Na continuação deste trabalho foi possível criar uma topografia com padrão bem organizado na superfície das membranas, alterando somente o material onde efetuamos a deposição das multicamadas. Esta estratégia visou mimetizar a topografia da ECM de diferentes tecidos, como o osso, a pele ou os nervos, criando canais alinhados na superfície do material. Usando este tipo de materiais multicamada padronizados foi possível modular funções e comportamentos celulares como o alinhamento ou a diferenciação. Em seguida, inspirados pela composição das proteínas que conferem adesividade aos mexilhões, foram produzidas membranas multicamada contendo HA modificado com dopamina (DN). A presença de DN ao longo da espessura das membranas multicamada parece ter contribuído para uma melhor e maior força de adesão, quando comparadas com as membranas controlo (membranas multicamada CHT/HA e CHT/ALG). Para além do mais, os testes in vitro resultaram em uma significante melhoria da adesão celular às membranas contendo DN. Esta estratégia mostrou ser promissora para diferentes aplicações biomédicas e de engenharia de tecidos, particularmente para a regeneração de tecido ósseo e a cicatrização de feridas da pele. Combinando diferentes estratégias e conceitos biomiméticos, foi também possível recriar um sistema complexo associado à cartilagem articular e concretamente a doenças como a osteoartrite. Assim sendo, na última parte desta tese, estas membranas multicamada com propriedades adesivas foram utilizadas como veículo para transportar células estaminais humanas do tecido adiposo (hASCs) para o local onde a cartilagem se encontra danificada. A presença deste tipo de células tem sido utilizada como tratamento para cartilagem danificada. Aqui, hASCs aderiram temporariamente às membranas multicamada, e foram assim transportadas diretamente para discos de cartilagem humana danificada, permitindo a criação de uma ponte celular entre as membranas e a superfície da cartilagem. Desta forma, estas células começaram a proliferar na superfície da cartilagem começando a migrar para os defeitos (em profundidade), segregando fatores capazes de ajudar na reparação da cartilagem. No geral, o trabalho desenvolvido para a presente tese mostra a grande versatilidade da técnica LbL, que proporciona os meios necessários para desenvolver uma gama alargada de materiais, estratégias e soluções muito necessárias e promissoras para aplicações biomédicas e de engenharia de tecidos e medicina regenerativa.