Deepening the study of the two-peptide lantibiotic lichenicidin: bioengineering, toxicity and mode of action

Abstract

Many novel peptides have recently been discovered and characterized that have been shown to be effective against clinically relevant strains, including multi-drug resistant bacteria. Lantibiotics are presented as an alternative to the more traditional antibiotics. The present study aimed to clarify aspects of the biosynthesis, structure, mode of action and toxicity of lichenicidin. Lichenicidin is a two peptide (Bliα and Bliβ) lantibiotic produced by B. licheniformis with bioactivity against Staphylococcus aureus and Listeria monocytogenes. It was the first lantibiotic to be produced totally in vivo in Escherichia coli. This system was used to produce variants of Bliα and Bliβ.The production levels, bioactivity and structure of such variants was compared with that of the native peptides. Variants with slightly improved bioactivity were identified and should be further characterized. Bliα Glu26 residue was found to be important for bioactivity and could not be replaced by other residues, even if negatively charged. In general, Ser and Thr can be replaced with each other, even in the positions involved in ring formation. Regarding Bliβ biosynthesis, the hexapeptide sequence is essential to the proteolysis step and to ensure the specificity of the modifying enzyme. In addition Bliβ biosynthetic enzymes were used to produce and secrete other peptides (including non-lantibiotics) in E. coli, opening new perspectives for the biotechnological application of these enzymes. Lichenicidin production in E. coli was improved by replacing the original genetic determinants and regulatory regions of Bacillus with those from E. coli and by producing Bliα and Bliβ separately. Lichenicidin purification method was also optimized to ensure high yields of pure peptides. In this process, it was found that Bliβ production is limited by the proteolytic step that occurs in the extracellular environment. Regarding antimicrobial activity, lichenicidin minimal inhibitory concentration (MIC) was determined against methicillin-sensitive and methicillin-resistant S. aureus strains (MSSA and MRSA), being higher for the latter. Separately, Bliα and Bliβ have bioactivity, although Bliβ activity is higher than Bliα, both are inferior to their synergistic activity. Time-kill assays showed that, at the MIC, lichenicidin inhibits MSSA in less than 3 h. For higher concentrations, rapid killing occurs, suggesting a mode of action consistent with a pore formation mechanism of action. In lipid membrane models (LUV), Bliβ is able to induce leakage. Bliα has low affinity for S. aureus membranes, but it strongly binds to lipid II-containing LUV, contributing to accelerate cell lysis. In addition, Bliα and Bliβ stabilize each other when binding to S. aureus cells. Furthermore, lichenicidin is not toxic against human erythrocytes and fibroblasts. This work gathers new and relevant information on lichenicidin, thus contributing to a better assessment of its possible biotechnological and therapeutic applications.

Recentemente, têm sido descobertos e caracterizados vários péptidos antimicrobianos eficazes contra estirpes bacterianas clinicamente relevantes, incluindo as multirresistentes. Neste contexto, os lantibióticos apresentam-se como uma possível alternativa aos antibióticos mais tradicionais. Este estudo teve como objetivo clarificar aspetos da biossíntese, estrutura, modo de ação e toxicidade da lichenicidina. A lichenicidina é um lantibiótico constituído por dois péptidos (Bliα e Bliβ), produzido por B. licheniformis e com atividade contra Staphylococcus aureus e Listeria monocytogenes. Foi o primeiro lantibiótico a ser produzido totalmente in vivo no hospedeiro Escherichia coli. Este sistema foi utilizado para expressar variantes de Bliα e Bliβ. Os níveis de produção, a bioactividade e a estrutura dessas variantes foram comparadas com os dos péptidos nativos. Identificarm-se algumas variantes com bioactividade ligeiramente melhorada, que deverão ser caracterizadas com maior detalhe no futuro. Verificou-se que o resíduo Glu26 do péptido Bliα é importante para a bioatividade e que não deve ser substituído por outros resíduos, mesmo que estes tenham carga negativa. De uma forma geral, em ambos os péptidos, os aminoácidos Ser e Thr podem ser substituídos entre si, mesmo quando estão envolvidos na formação dos anéis. Relativamente à biossíntese do péptido Bliβ, determinou-se que o hexapéptido é uma sequência essencial para a sua proteólise, bem como para a especificidade da sua enzima modificadora. Foi ainda possível utilizar enzimas biosintéticas de Bliβ para produzir e secretar outros péptidos (incluindo não lantibióticos) em E. coli, o que abriu novas perspetivas para a aplicação biotecnológica destas enzimas. A produção da lichenicidina em E. coli foi melhorada pela substituição dos determinantes e reguladores genéticos de Bacillus pelos de E. coli e pela produção em separado dos péptidos Bliα e Bliβ. O método de purificação foi otimizado de forma a garantir a obtenção dos péptidos Bliα e Bliβ puros e em níveis elevados. Neste processo, verificou-se que a produção de Bliβ é limitada pela etapa de proteólise que ocorre no espaço extracelular. Relativamente à atividade antibacteriana, determinou-se a concentração mínima inibitória (CMI) da lichenicidina e concluiu-se que esta tem atividade contra estirpes de S. aureus sensíveis e resistentes à meticilina (MSSA e MRSA), embora a CMI seja superior para as últimas. Separadamente, Bliα e Bliβ têm bioatividade, apesar de a atividade de Bliβ ser superior à de Bliα, ambas são inferiores à atividade sinergística dos dois péptidos. Os testes de tempo-dependência revelaram que, à CMI, a lichenicidina inibe completamente o crescimento de MSSA em menos de 3h. A concentrações superiores, a taxa de morte é acelerada, o que aponta para um modo de ação que envolve a lise celular. Em modelos lipídicos de membrana (LUV), Bliβ é capaz de induzir vazamento da célula, possivelmente através da formação de poros na membrana. Bliα tem baixa afinidade para a membrana de S. aureus, mas liga-se fortemente a LUV contendo lípido II, o que contribui para acelerar o processo de vazamento do conteúdo intracelular. Verificou-se ainda que Bliα e Bliβ estabilizam-se mutuamente na interação com as células de S. aureus. Por último, confirmou-se que a lichenicidina não é tóxica para células humanas, como eritrócitos e fibroblastos. Este trabalho reuniu informação nova e relevante sobre a lichenicidina, contribuindo assim, para uma melhor avaliação das suas possíveis aplicações biotecnológicas e terapêuticas.