Lipidomics and immune system evaluation in hepatocellular carcinoma and cholangiocarcinoma

Abstract

Liver cancer comprises a heterogeneous group of malignant tumors with different histological features that include hepatocellular carcinoma (HCC) and cholangiocarcinoma (CCA), among other neoplasms. HCC and CCA present limited options for effective therapeutic strategies, being ablation, surgical resection and/or transplantation the only curative treatments applied so far. In addition, these carcinomas are characterized by a high recurrence rate after surgical resection. Therefore, novel treatment strategies and/or mechanism to determine therapy response are needed to improve the prognosis of HCC and CCA patients. Immunotherapybased approaches represent an alternative very promising for liver cancer. However, predicting responders and non-responders to immune therapies remains a challenge. The present Thesis had as main objective to advance and deepen the current knowledge on the relationship between cancer and immunity as well as to characterize the immune and the lipidomic context in liver cancer patients. To do so, a deep functional and phenotypical characterization of tumorinfiltrating leukocyte (TIL) subsets and circulating immune cells was performed by multi-color flow cytometry. Purification of immune cell populations by cell sorting was carried out for subsequent analysis of mRNA expression of immune mediators by qRT-PCR. ELISA techniques were used to quantify immune mediators in patients’ sera. Additionally, highresolution LC-MS base lipidomic approach was applied to monitor peripheral changes in the phospholipidome of cancer patients, before and after tumor resection, providing an indirect read of the lipid changes induced by the surgical procedure. A higher infiltration of protumor macrophages in HCC classified into high-grades or into highrisk was detected. A pro-inflammatory state was observed both in HCC and CCA patients, and functional defects of some circulating monocyte subsets and myeloid dendritic cells were also detected, displaying partial recovery after tumor resection. TNFα mRNA expression by circulating monocytes as well as serum TNFα levels were associated to the presence of highgrade tumors. The frequency of circulating Treg cells in HCC and CCA patients was decreased, being partially recovered after tumor resection. Moreover, the frequency of circulating Tc17 cells as well as CD4 T lymphocytes with the plasticity to produce both IFNγ and IL-17 cytokines were decreased in CCA and HCC patients, suggesting a specific migration to the tumor microenvironment. Furthermore, it was revealed that the alterations identified in the phospholipidome of liver cancer patients were affected by tumor resection procedure. The results obtained showed that the alterations observed in the phospholipidic profile of liver cancer patients were reverted after surgery. Overall, the studies presented in this Thesis reported the utility of multi-color flow cytometry to detect functional and phenotypic differences in TIL subsets from patients with different types of cancer (CCA vs. HCC), different tumor histopathological grades, and different risk stratification classifications, in addition to monitoring functional competence of circulating immune cells to better evaluate immune dysfunctions in cancer patients. Besides, high-resolution LC-MS was demonstrated as being a usefulness technique to monitor peripheral changes in the phospholipid profile of liver cancer patients that could be used to predict patients’ outcomes after surgery.

O cancro do fígado compreende um grupo heterogéneo de tumores malignos com diferentes características histológicas que incluem o carcinoma hepatocelular (HCC) e o colangiocarcinoma (CCA), entre outras neoplasias. O HCC e o CCA apresentam poucas estratégias terapêuticas eficazes, sendo a ablação, resseção cirúrgica e/ou o transplante os únicos tratamentos curativos aplicados até o momento. Além disso, estes carcinomas são caracterizados por uma alta taxa de recorrência após a resseção cirúrgica. Portanto, são necessárias novas estratégias de tratamento e/ou mecanismos para determinar a resposta à terapia, de forma a melhorar o prognóstico dos pacientes com estes tipos de tumores. As abordagens baseadas em imunoterapia representam uma alternativa muito promissora para o cancro do fígado. No entanto, a capacidade de prever e avaliar se os indivíduos estão a responder às terapias imunológicas instituídas é, ainda, um desafio. A presente Tese teve como objetivo principal aprofundar o conhecimento atual sobre a relação entre o cancro e o sistema imune, bem como caracterizar o contexto imune e lipidómico em doentes com cancro do fígado. Para isso, foi realizada uma caracterização funcional e fenotípica das subpopulações do infiltrado leucocitário tumoral (TIL) e das células imunes circulantes, por citometria de fluxo. Além disso, procedeu-se à purificação de populações de células imunes por “cell sorting” para posterior caracterização da expressão de mRNA de mediadores da resposta imune por qRT-PCR. Utilizou-se, ainda, a técnica de ELISA para quantificar mediadores imunes no soro dos pacientes. Por fim, abordagens modernas de lipdómica por LC-MS foram utilizadas para monitorizar as alterações periféricas no fosfolipidoma de doentes com cancro, antes e após a resseção do tumor. Os resultados obtidos permitiram detetar uma maior infiltração de macrófagos pró-tumorais em HCC de alto grau ou alto risco. Foi ainda observado um estado pró-inflamatório tanto em pacientes com HCC como com CCA, e alterações funcionais em algumas subpopulações de monócitos circulantes e em células dendríticas mielóides, observando-se uma recuperação parcial da função após a resseção do tumor. É ainda de salientar que a expressão de TNFα por monócitos circulantes, bem como os níveis séricos de TNFα, se encontravam associados à presença de tumores de alto grau. A frequência de células Treg circulantes em pacientes com ambos tipos de tumores foi modulada após o período necessário à recuperação da cirurgia de resseção do tumor. A frequência de células Tc17 circulantes e dos linfócitos T CD4 com plasticidade para produzir as citocinas IFNγ e IL-17 diminuiu em doentes com CCA e HCC, sugerindo uma migração específica para o microambiente tumoral. Além disso, as alterações identificadas no fosfolipidoma de pacientes com cancro do fígado foram afetadas pelo procedimento de resseção tumoral. Os resultados obtidos pelos estudos lipidómicos evidenciaram que, após a cirurgia, as alterações observadas no perfil fosfolipídico dos doentes com cancro do fígado são revertidas. No geral, os estudos apresentados nesta tese demostraram a aplicabilidade da citometria de fluxo para detetar diferenças funcionais e fenotípicas em subpopulações TIL de pacientes com diferentes tipos de cancro (CCA vs. HCC), diferentes graus histopatológicos do tumor e diferentes estratificações de risco, além de monitorizar a competência funcional das células imunes em circulação para avaliar melhor a função imune em doentes com cancro. Por outro lado, a técnica LC-MS de alta resolução mostrou ser uma abordagem promissora para monitorizar alterações periféricas no perfil fosfolipídico de doentes com cancro do fígado, como um meio de avaliar a evolução dos doentes após a cirurgia