Production and purification of anti-human interleukin- 8 monoclonal antibodies

Abstract

Over the past few years, monoclonal antibodies (mAbs) have gained interest as alternative therapy. In particular, anti-interleukin-8 (anti-IL-8) mAbs have shown high potential for the treatment of inflammatory diseases, since they reduce neutrophil infiltration in the early stage of inflammation. However downstream processing has not evolved at the same rate as upstream, being considered the limiting and most costly step in the production of these biopharmaceuticals. The conventional platform adopted for the purification of IgG, counts on a primary antibody capture step by protein A affinity chromatography. This technique is extremely costly - with two chromatographic purification steps. Nevertheless, the high costs and intrinsic limitations on the use of the ligand itself are other disadvantages of using protein A affinity chromatography. In order to develop an alternative process based on the use of ionic liquids (ILs) as chemical ligands, this dissertation investigated three supported ionic liquid phase materials ([Si][C3C1im]Cl, [Si][N3444]Cl and [Si][N3888]Cl) as alternative matrices for the extraction and/ or purification of antibodies, namely IgG from complex biological matrices (human serum, rabbit serum and Chinese hamster ovary cell culture supernatants). Initially, the operating conditions of the process were optimized, namely the solid: liquid ratio (S:L ratio), pH and contact time (t), in order to maximize the process performance parameters. Best results were obtained using [Si][C3C1im]Cl (S:L ratio= 150 mg.mL-1 ; pH 12; t= 60 min) and [Si][N3888]Cl (S:L ratio= 100 mg.mL-1 ; pH 11; t= 60 min), where it was possible to obtain 59% and 76% IgG yields with 84% and 100% purity levels respectively. Moreover, the IgG purification mechanism was found to be highly dependent on the supported IL structure, being flowthrough-like mode using [Si][C3C1im]Cl and bin-and-elutelike mode with [Si][N3888]Cl. Thus, two new, more efficient and economical strategies for downstream antibody processing have been developed, representing important advances in the biopharmaceutical field.

Ao longo dos últimos anos, os anticorpos monoclonais (mAbs) têm vindo a ganhar interesse crescente como terapia alternativa. Em particular, os mAbs anti-interleucina-8 (anti-IL-8) têm apresentado elevado potencial para o tratamento de doenças inflamatórias, uma vez que reduzem a infiltração de neutrófilos no estágio inicial da inflamação. Contudo o processamento a jusante não evoluiu ao mesmo ritmo que o processamento a montante, sendo considerado atualmente como a etapa limitante e dispendiosa na produção destes biofármacos. A plataforma convencional adotada para a purificação de IgG conta com uma etapa primária de captura do anticorpo através da cromatografia de afinidade com a proteína A. Esta técnica é extremamente dispendiosa –,onde apresenta duas etapas cromatográficas de purificação. No entanto, os elevados custos e as limitações intrínsecas ao uso do próprio ligando são outras desvantagens da utilização de cromatografia de afinidade com proteína A. Com vista ao desenvolvimento de um processo alternativo baseado na utilização de líquidos iónicos (LIs) como ligandos químicos, nesta tese de mestrado procedeu-se à investigação de três materiais com líquidos iónicos suportados ([Si][C3C1im]Cl, [Si][N3444]Cl, [Si][N3888]Cl) como matrizes alternativas para a extração e/ou purificação de anticorpos, nomeadamente a IgG de matrizes biológicas complexas (soro humano, soro de coelho e sobrenadantes de culturas celulares de ovário de hamster chinês). Inicialmente, foram otimizadas as condições operacionais do processo, nomeadamente a razão sólido:líquido (razão S:L), p e tempo de contacto (t) de forma a maximizar os parâmetros de performance do processo. Os melhores resultados foram obtidos utilizando [Si][C3C1im]Cl (razão S:L = 150 mg.mL-1 ; pH 12; t = 60 min) e [Si][N3888]Cl (razão S:L = 100 mg.mL-1 ; pH 11; t = 60 min) em que foi possível obter rendimentos de IgG de 59% e 76% com níveis de pureza de 84% e 100%, respetivamente. Mais ainda, verificou-se que o mecanismo de purificação de IgG é altamente dependente da estrutura do LI suportado, sendo “flowthrough-like mode” utilizando [Si][C3C1im]Cl e “bin-and-elute-like mode” com [Si][N3888]Cl. Assim, duas novas estratégias mais eficientes e económicas para o processamento a jusante de anticorpos foram desenvolvidas, representando importantes avanços na área biofarmacêutica.