Metabolomics study of the effects of eucalyptus bark compounds on human breast tumor and non-tumor epithelial cells

Abstract

Agro-industrial exploitation of eucalyptus for pulp production generates large amounts of biomass residues, particularly bark. Eucalyptus spp. barks are a rich source of several triterpenoids, mostly triterpenic acids (TAs). TAs have been demonstrated to modulate numerous signaling pathways involved in carcinogenesis, which may be closely linked to cellular metabolic reprogramming. Given the limited information on the metabolic modulatory activity of eucalyptus bark compounds, the work performed in this thesis aimed at comprehensively assessing the metabolic effects of a lipophilic E. nitens outer bark extract and two TAs (betulinic and ursolic acids) in triple negative breast cancer (TNBC) and non-tumor breast cells. Integrative NMR metabolomics of cell culture media, intracellular polar metabolites and cellular lipids was used for that purpose. Chapter 1 introduces some general aspects on breast cancer, such as subtype classification and therapeutic options, and informs on current uses of plant-derived natural products in anticancer therapy, focusing on TAs. Then, the main metabolic dysregulations known to be associated with breast cancer are reviewed, as well as current knowledge on metabolic modulation by TAs and other isoprenoids. Finally, the metabolomics approach is presented, together with a brief state of the art on its applications in the study of breast cancer cells and their metabolic responses to plant-derived natural products. In Chapter 2, the basal metabolic activity and composition of the two cell types used in this work (MDA-MB-231 TNBC cells and MCF-10A non-tumor epithelial cells) are thoroughly described. Based on consumption and excretion patterns, together with analysis of polar endometabolome and lipid composition, metabolic pathway differences were inferred and correlated with the high demand of TNBC cells for macromolecular biosynthesis, energy production and redox control. Chapter 3 addresses the effects of a lipophilic E. nitens outer bark extract on the metabolism of MDA-MB-231 and MCF-10A cells. Incubation of TNBC cells with this extract (15 µg/mL) strongly affected the cellular metabolome. Several pathways appeared to be modulated towards mitochondrial respiration enhancement, as evidenced by significantly increased NAD+ /NADH ratios in treated cells. Downregulation of choline kinase (ChoK-α) expression and the content of phosphocholine, often regarded as a marker of breast cancer aggressiveness, was also observed. In MCF-10A epithelial cells, the lipophilic E. nitens outer bark extract had an overall milder impact, characterized by intensification of glycolysis and no effect on the cells lipid composition. The metabolic responses of TNBC cells and breast epithelial cells to betulinic acid (BA) and ursolic acid (UA) (abundant TAs present on the lipophilic E. nitens outer bark extract) are presented in Chapter 4. In MDA-MB231 cells, BA was suggested to induce upregulation of glycolytic and TCA cycle activity, together with hydrolysis of neutral lipids and buildup of membrane phospholipids. UA effects were less pronounced upon 48h incubation, but after a recovery period in fresh growth medium, downregulation of glycolysis and decreased ATP levels were observed. In MCF-10A cells, both TAs appeared to reprogram glucose metabolism towards glycogen degradation, intensification of glycolysis, upregulation of the hexosamine biosynthetic pathway, membrane degradation and formation of lipid droplets, likely to scavenge otherwise-toxic lipid species. Overall, this thesis is believed to significantly contribute to advance knowledge on the metabolic modulatory activity of a lipophilic E. nitens bark extract, as well as of ursolic and betulinic pure acids, in TNBC and non-tumor breast epithelial cells. As outlined in the final Chapter 5, the new findings reported provide remarkable insight into the mode of action of eucalyptus bark compounds and open new research perspectives to support their future development in the field of anticancer therapy.

A exploração agroindustrial do eucalipto para a produção de pasta de celulose gera uma grande quantidade de resíduos de biomassa, casca em especial. A casca de Eucalyptus spp é uma fonte generosa de diversos triterpenóides, principalmente ácidos triterpénicos. Os ácidos triterpénicos têm demostrado capacidade de modular inúmeras vias de sinalização envolvidas no processo de carcinogénese, que, por sua vez, poderão estar intrinsecamente relacionadas com a reprogramação metabólica celular. Dada a escassa informação sobre a atividade modulatória dos compostos da casca de eucalipto no metabolismo, o trabalho realizado nesta tese pretendeu determinar, de forma abrangente, os efeitos metabólicos de um extrato lipofílico da casca externa de E. nitens e de dois ácidos triterpénicos (betulínico e ursólico) em células de cancro da mama triplo negativo e células epiteliais não tumorais de mama. Para este efeito, utilizou-se a metabolómica por espectroscopia de RMN, que permitiu uma análise integrada de meio de cultura e extratos celulares (aquosos e orgânicos). O Capítulo 1 introduz alguns aspetos gerais sobre o cancro da mama, como a classificação em subtipos e a abordagem terapêutica, e informa acerca do uso de compostos naturais derivados de plantas no tratamento do cancro, focando-se nos ácidos triterpénicos. Seguidamente, as principais desregulações no metabolismo associadas ao cancro da mama são apresentadas, bem como o conhecimento atual sobre a modulação metabólica induzida por ácidos triterpénicos e outros isoprenóides. Finalmente, apresenta-se a abordagem metabolómica, em conjunto com um breve estado da arte sobre as suas aplicações no estudo de células tumorais de mama e a sua reposta metabólica a compostos naturais derivados de plantas. No Capítulo 2, a atividade metabólica basal e a composição dos dois tipos de células utilizados neste trabalho (células de cancro da mama triplo negativo MDA-MB-231, e células epiteliais mamárias não tumorais MCF-10A) são detalhadamente descritas. Os padrões de consumo e excreção celulares, juntamente com a análise do endometaboloma polar e da composição lipídica sugeriram diferenças em várias vias metabólicas, relacionadas com as maiores necessidades das células tumorais em termos de biossíntese, produção de energia e controlo do estado redox. O Capítulo 3 aborda os efeitos de um extrato lipofílico da casca externa de E. nitens no metabolismo das células MDA-MB-231 e MCF-10A. As células MDAMB-231 incubadas com este extrato (15 µg/mL) mostraram grandes alterações no metaboloma celular. Diversas vias metabólicas aparentaram ser moduladas de forma a favorecer o incremento da respiração mitocondrial, facto evidenciado pelo aumento significativo da razão NAD+ /NADH em células tratadas. Observou-se também a diminuição da expressão proteica de colina quinase (ChoK-α) e do teor relativo em fosfocolina, habitualmente associada a um fenótipo agressivo de cancro da mama. Nas células epiteliais de mama MCF-10A, o extrato lipofílico da casca externa de E. nitens originou, em geral, um efeito mais moderado, caracterizado pela intensificação da glicólise, não tendo produzido quaisquer efeitos na composição lipídica das células.A resposta metabólica das células de cancro da mama triplo negativo e das células epiteliais não-tumorais de mama ao ácido betulínico e ao ácido ursólico (ácidos triterpénicos abundantes no extrato lipofílico da casca externa de E. nitens) é apresentada no Capítulo 4. Nas células MDA-MB-231, o ácido betulínico pareceu ter induzido um aumento na glicólise e na atividade do ciclo dos ácidos tricarboxílicos, em conjunto com a hidrólise de lípidos neutros e acumulação de fosfolípidos de membrana. Os efeitos do ácido ursólico foram menos acentuados após as 48h de incubação, mas após um período de recuperação em meio de cultura celular, foi observada a diminuição da glicólise e dos níveis de ATP. Nas células MCF-10A, ambos os ácidos triterpénicos aparentaram reprogramar intensamente o metabolismo da glucose no sentido da degradação de glicogénio, intensificação da glicólise, aumento da via biossintética das hexosaminas, degradação da membrana celular e formação de gotas lipídicas (possivelmente para eliminar espécies tóxicas). Em suma, esta tese contribui de forma significativa para fazer avançar o conhecimento sobre a atividade metabólico-modulatória do extrato lipofílico da casca externa de E. nitens, assim como dos ácidos ursólico e betulínico, em células do cancro da mama triplo negativo e em células não-tumorais epiteliais de mama. Como referido no Capítulo 5, os resultados aqui descritos fornecem pistas novas e relevantes sobre o modo de ação dos compostos da casca de eucalipto e abrem novas perspetivas de investigação que sustentam o seu futuro desenvolvimento na área da terapia anticancro.