Optimization of phorotannins extraction and evaluation of antioxidant and anti-inflammatory properties of Fucus vesiculosus

Abstract

Phlorotannins, a class of polyphenols exclusive to brown seaweeds, have been associated with numerous health-promoting properties. In this, the objective of the master's thesis was to optimize the extration process of phlorotannins from the seaweed Fucus vesiculosus, using microwave-assisted extraction methodology and a green solvent, such as ethanol, as well as to characterize the constituents of the obtained extracts and to realize its biological potentialities. The optimization of the microwave extraction process was performed by singlefactor analysis followed by Box-Behnken analysis, considering the maximum recovery of phlorotannins, yielding a maximum of 3.16 ± 0.17 mg phloroglucinol equivalents/g dry weightalgae. The crude extract obtained was partitioned and the resulting fractions, n-hexane (Hex), ethyl acetate (EtOAc) and aqueous (Aq), were characterized by UHPLC-DAD-ESI/MS. Both crude extract and purified fractions were screened for antioxidant capacity by in chemico assays. Additionally, fractions with better antioxidant capacity, namely EtOAc and Hex, were tested on lipopolysaccharide-stimulated RAW 267.4 macrophages. The chemical analysis of the purified fractions allowed to identify some phlorotannins, mainly in EtOAc and Aq. On the other hand, the Hex fraction was rich in fucoxanthin, which along with other pigments, was also present in the EtOAc fraction. Overall, the EtOAc and Hex fractions were shown to be most effective regarding the antiradical capacity, and in particular against the nitric oxide radical. Both these fractions reduced significantly the nitrite levels produced by activated macrophages without causing a decrease in their cellular metabolism. In addition they were able to downregulate the inflammationmediating enzyme iNOS and, particularly EtOAc reduced the levels of COX-2. It is possible that these facts can be related with the transcriptional factor NF-kB, since the expression of p65 subunit was significantly decreased in the cellular lysates of the pre-treated macrophages, followed by the inhibition of p-IkB-α phosphorylation. Taken together, the findings from the present dissertation suggest that EtOAc and Hex fractions of F. vesiculosus have relevant antioxidant and anti-inflammatory activities.

Os florotaninos, uma classe de polifenóis exclusiva das algas castanhas, demonstraram e têm sido associados a numerosas propriedades benéficas para a saúde. Tendo isto em consideração, esta dissertação de mestrado teve como objetivo a otimização do processo de extração de florotaninos da alga Fucus vesiculosus através do método de microondas usando um solvente “verde”, como o etanol, bem como caracterizar os constituintes dos extratos obtidos e perceber as suas potencialidades biológicas. A otimização do processo de extração por microondas foi realizada através da análise do fator único seguido da análise por Box-Behnken, tendo em vista a recuperação máxima total de florotaninos, tendo esta resultado num valor máximo de 3,16 ± 0,17 mg equivalentes de floroglucinol/g peso secoalga. O extrato bruto obtido foi submetido a partição líquido-líquido e as frações resultantes, n-hexano (Hex), acetato de etilo (EtOAc) e aquosa (Aq), foram caracterizadas por UHPLC-DADESI/MS. Quer o extrato bruto quer as frações purificadas foram rastreadas em relação às suas capacidades antioxidante através de métodos químicos. Adicionalmente, as frações com melhor capacidade antioxidante, nomeadamente, EtOAc e Hex, foram testadas em macrófagos RAW 267.4 estimulados com lipopolissacarídeo. A análise química das frações purificadas permitiu identificar alguns florotaninos principalmente na fração EtOAc e Aq. Por outro lado, a fração de Hex era rica em fucoxantina, estando esta também, juntamente com outros pigmentos, presente na fração EtOAc. No global, as frações EtOAc e Hex demostraram ser as mais eficazes relativamente à capacidade antiradical, e em especial, contra o radical de óxido nitrico. Esta duas frações reduziram também significativamente os níveis de nitritos produzidos pelos macrófagos ativados, sem causar decréscimo no seu metabolismo celular. Ainda, ambas provocaram uma redução drásticas na expressão de iNOS e, em particular a fração de EtOAc, induziu um decréscimo da expressão da COX-2. É possivel que estes factos estejam relacionados com a regulação do fator transcricional NF-kB, uma vez que foi observado uma diminuição do teor da subunidade p65 nos lisados celulares dos macrófagos pré-tratados, acompanhado pela inibição da fosforilação do p-IkB-α. Em conclusão, os resultados da presente dissertação sugerem que as frações EtOAc e Hex de F. vesiculosus possuem atividades antioxidantes e anti-inflamatórias relevantes.