Study of the role of Rabconnectin-3a at the auditory hair cell ribbon synapse

Abstract

Inner hair cells (IHCs) are the sound sensing cells of the auditory organ. The synaptic activity capabilities that these cells have can be attributed to the presence of ribbons anchored in the active zone of the IHC synapse. The ribbons are an electron dense structures responsible for the tethering of synaptic vesicles. Synaptic vesicles are composed of lipids and many proteins, one of which is Rabconnectin-3a, a subunit of the Rabconnectin-3 complex. This complex is found abundantly in the brain, particularly at the synapses where it is important for neurotransmission. Rabconnectin-3a protein is a putative V-ATPase regulator with an important role in brain development. This protein is encoded by the DMXL2 gene. Mutations in the DMXL2 gene are linked to hearing impairment and neurodevelopmental disorders. In this work it was proposed to study the role of Rabconnectin-3a in IHC ribbon synapse. To achieve this goal a Rabconnectin-3a knock-out (KO) mouse model in IHCs was used, where apical turns of the organ of Corti were dissected, immunolabelled and imaged. Also, the protein samples were prepared from the whole cochlea and subjected to Western blotting (WB) technique. Together, these two techniques have enabled the quantification of protein levels, as well as their distribution in the ribbon synapse. A significant decrease in the expression of V-ATPase subunits needed for synaptic vesicle acidification and refilling, and otoferlin protein needed for calcium sensing were observed in the Rabconnectin-3a IHC KO mice in comparison with the Wild-Type (WT) controls, suggesting an impairment in IHC transmission. Also, the number of ribbons was higher in the Rabconnectin-3a KO IHC in comparison with the WT. This could be due to a developmental impairment. On the other hand, both Rabconnectin-3β (other component of Rabconnectin-3 complex) and vesicular glutamate transporter 3 (vGlut3) protein levels are increased in the Rabconnectin-3a KO mouse. Overall, the results obtained in this work provided new insights on the role of Rabconnectin-3a at the mammalian IHC ribbon synapse.

As células ciliadas internas são as células sensitivas do órgão auditivo. A capacidade que demonstram para prolongar a atividade sináptica pode ser atribuída à presença de corpos sinápticos ancorados na zona ativa da sinapse das células ciliadas auditivas. Os corpos sinápticos são estruturas densas responsáveis pela ancoragem de vesículas sinápticas. Rabconnectin-3a é uma subunidade do complexo rabconnectin-3. A rabconnectina-3a está presente nas vesículas sinápticas, mas também pode ser observada em outras estruturas neuronais. Este complexo é encontrado em abundância no cérebro, particularmente na sinapse, onde tem um papel importante na neurossecreção. A proteína Rabconnectin-3a é um conhecido regulador putativo da V-ATPase. Esta proteína é codificada pelo gene DMXL2. Estudos anteriores mostraram um papel importante desta proteína no desenvolvimento do cérebro. Sendo que as mutações no DMXL2 estão ligadas a deficiência auditiva e a distúrbios do desenvolvimento neurológico. Assim, neste trabalho foi proposto estudar o papel da Rabconnectina-3a na sinapse da célula ciliada interna auditiva. Para atingir este objetivo, foi utilizado um modelo de murganho KO específico para a rabconnectin-3a nas células ciliadas internas, onde as partes apicais do órgão de Corti foram dissecadas e marcadas imunologicamente. Além disso, amostras de cóclea inteira foram preparadas e submetidas à técnica de Western Blotting (WB). Juntas, essas duas técnicas permitiram a quantificação dos níveis de proteínas, bem como a visualização da sua distribuição na sinapse da célula ciliada interna. Foi observada uma diminuição significativa nas subunidades da V-ATPase e na expressão da proteína otoferlin nos murganhos KO em comparação com os controlos Wild Type (WT), sugerindo uma diminuição no processo de reciclagem da vesícula sináptica. Além disso, o número de corpos sinápticos observado nos murganhos KO foi maior comparativamente com o WT. O que pode ser devido a um comprometimento do desenvolvimento da sinapse. Por outro lado, os níveis das proteínas rabconnectin-3β e vGlut3 estão aumentados no modelo do murganho KO. De uma forma geral, os resultados obtidos neste trabalho forneceram novas informações sobre o papel da rabconnectina-3a na sinapse das células ciliadas internas de mamíferos.