Marine macroalgae as functional food and biotechnological potential: DNA integrity promotion and underlying mechanisms

Abstract

Nowadays, there is an increasing demand for food products or bioactive compounds with potential to enhance human health, highlighting the importance of building a cutting edge and scientifically supported knowledge on that regard. In this context, marine macroalgae comprise one of the most promising natural resources, especially considering their large biodiversity and rich phytochemical profile. In fact, marine macroalgae are currently labelled as functional food, since they have demonstrated to hold a multiplicity of beneficial properties, namely antiviral, antifungal, antibacterial, antihypertensive, antidiabetic, neuroprotective, anti-inflammatory, immunomodulatory, among other effects. Besides these health-promoting properties, marine macroalgae are an important element of the diets of several Eastern countries, some of them depicting the highest life expectancy rates and low incidence of diet-related chronic diseases (e.g. cardiovascular diseases and cancer), namely Japan or South Korea. Despite that, there are only a few studies addressing their genome protective capacity, providing some clues concerning macroalgae antioxidant, antigenotoxic and antimutagenic properties. Bearing in mind the importance of the genome integrity and stability, as well as the causal linkage between the DNA damage and multiple diseases, this thesis was built up on the hypothesis that marine macroalgae consumption, as whole food, could be translated on a genoprotective action. Hence, the main goal was to address the properties of the marine macroalgae Ulva rigida (sea lettuce), Fucus vesiculosus (bladderwrack) and Graciliaria (ogonori) towards the DNA integrity promotion and underlying mechanisms. Moreover, as a secondary objective, it was intended to assess the genoprotection afforded by those marine macroalgae included in the diets of farmed fish and human driven models, validating their concept as functional feed/food, especially, in the context of aquaculture and human nutrition. Therefore, four experimental trials were delineated and, in all of them, the respective organisms’ diet was supplemented with the described marine macroalgae species, either individually or in a mix with equal parts of the three species.In the first trial, the gilthead seabream (Sparus aurata) diet was supplemented with aquacultured U. rigida, F. vesiculosus and G. gracilis (5% of supplementation) for 60 days, followed by the treatment of fish with realistic doses/intervals of two aqua-medicines frequently adopted in aquaculture to prevent and/or treat diseases, oxytetracycline (OTC) and formalin (FOR). The genetic damage was assessed by the erythrocytic nuclear abnormalities (ENA) assay and, to shed light on the modulation of the erythrocytic population dynamics, the erythrocyte maturity index (EMI) was also assessed. The macroalgae-supplemented aquafeed evidenced a solid genoprotection against the toxicity induced by the aqua-medicines OTC and FOR, and model genotoxicant, cyclophosphamide (CP). Moreover, OTC and FOR induced an erythrocyte population instability (translated into an aging effect), which was counteracted by the algae supplementation. In turn, U. rigida, F. vesiculosus and two species of Gracilaria, G. vermiculophylla and G. gracilis, were individually tested through their incorporation on the fruit fly (Drosophila melanogaster) diet, at 2.5 and 5%, 1.25 and 5% and 1.25 and 10% of supplementation, respectively. In this trial, the macroalgae incorporated were from aquaculture or wild origin, to evaluate the influence of the growing conditions on the genome protective potential. The macroalgae antigenotoxic potential against the basal and streptonigrin-induced genetic damage was evaluated through the somatic mutation and recombination test (SMART). Marine macroalgae showed to enhance genome protection, especially against the genetic damage induced by streptonigrin. While U. rigida revealed differences on the antigenotoxic potential associated with the growing conditions (higher genoprotective action afforded by the aquacultured alga), F. vesiculosus depicted similar responses between origins. In turn, Gracilaria showed rather contradictory indications, since the lowest supplementation level enhanced the genome integrity, while the highest showed toxicity signals, especially the wild-harvested species. Furthermore, in the second trial with D. melanogaster, the two U. rigida batches from aquaculture and wild origin (2.5 and 5% supplementation) confirmed to hold differences on the genome protective potential, evaluated through the comet assay improved with the adoption of the endonucleases formamidopyrimidine DNA glycosylase (FPG) and endonuclease III (EndoIII). Although U. rigida from both origins showed a DNA-protective action, especially against the streptonigrin-induced genetic damage, an origin-based genoprotection capacity was evident, since aquacultured alga demonstrated higher antigenotoxic potential. This may be attributed to the phytochemical profile, determined through gas chromatography- and ultra-high-performance liquid chromatography-mass spectrometry analyses, depicting differences on the relative quantity of some phytocompounds, namely fatty alcohols, sterols, sesquiterpenoids and glycerol esters. In the mice (Mus musculus) trial, the antigenotoxic potential of aquacultured macroalgae U. rigida, F. vesiculosus and G. gracilis was investigated, through the comet and the micronucleus assays, considering either a direct consumption (5% supplementation) or an indirect intake via fish (S. aurata) (10% supplementation) that was previously fed with an algae-supplemented diet. The direct consumption of the macroalgae mixture allowed the genoprotection against the methyl methanesulfonate-induced genotoxic damage, besides the accomplishment of a more favourable oxidant status, thus possibly involving desmutagens substances. In turn, the hypothesis concerning the transference of macroalgae genoprotective properties via consumption of fish fed with an algae-supplemented feed was not confirmed. Nevertheless, the transference of the macroalgae phytocompounds is plausible, particularly considering the achievement of a lower pro-oxidant challenging condition. This thesis carries new perspectives regarding the marine macroalgae beneficial properties towards the genome integrity. In fact, U. rigida, F. vesiculosus and Gracilaria species revealed to enhance the genome protection both in farmed fish and human driven models. Overall, the present findings convey new evidences likely to contribute to the development of algaculture and pisciculture industries, as well as to the redefinition of human nutritional habits, reinforcing and validating the concept of marine macroalgae as functional food/feed and subsequent health benefits.

Atualmente, assiste-se a uma crescente procura por alimentos ou compostos bioativos com potencial para melhorar a saúde humana, evidenciando a importância de construir, a esse respeito, um conhecimento de vanguarda e cientificamente suportado. Neste contexto, as macroalgas marinhas constituem um dos mais promissores recursos naturais, tendo em conta, especialmente, a sua vasta biodiversidade e rico perfil fitoquímico. De facto, as macroalgas marinhas são, atualmente, classificadas como alimentos funcionais, tendo demonstrado possuir uma multiplicidade de propriedades benéficas, nomeadamente antiviral, antifúngica, antibacteriana, anti-hipertensiva, antidiabética, neuroprotetora, anti-inflamatória, imunomoduladora, entre outras. Além destas propriedades promotoras da saúde, as macroalgas marinhas são um elemento importante das dietas de vários países orientais, alguns deles revelando as mais elevadas taxas de esperança média de vida e baixa incidência de doenças crónicas relacionadas com a dieta (ex: doenças cardiovasculares e cancro), como o Japão e a Coreia do Sul. Apesar disto, apenas alguns estudos abordaram a sua capacidade protetora do genoma, fornecendo algumas pistas sobre as propriedades antioxidante, antigenotóxica e antimutagénica das macroalgas. Tendo em mente a importância da integridade e da estabilidade do genoma, assim como a ligação causal entre o dano no ADN e múltiplas doenças, esta tese foi alicerçada na premissa de que o consumo de macroalgas marinhas, como alimento integral, pode traduzir-se numa ação genoprotetora. Assim, o principal objetivo foi avaliar as propriedades das macroalgas marinhas Ulva rigida (alface-do-mar) Fucus vesiculosus (bodelha) e Gracilaria (cabelo-de-velha) em relação à promoção da integridade do ADN e os mecanismos subjacentes. Além disso, como objetivo secundário, pretendeu-se avaliar a genoproteção promovida por aquelas macroalgas marinhas quando incluídas nas dietas de peixes de aquacultura e de organismos-modelo de investigação focada no Homem, validando a sua assunção como ração/alimento funcional, especialmente, no contexto de aquacultura e de nutrição humana. Deste modo, foram delineados quatro ensaios experimentais e, em todos eles, a dieta dos respetivos organismos foi suplementada com as espécies de macroalgas marinhas descritas, ou individualmente ou em mistura das três espécies em partes iguais. No primeiro ensaio, a dieta de dourada (Sparus aurata) foi suplementada com U. rigida, F. vesiculosus e G. gracilis de aquacultura (5% de suplementação) durante 60 dias, a que se seguiu o tratamento dos peixes com doses/intervalos realistas de dois medicamentos frequentemente adotados em aquacultura para prevenir e/ou tratar doenças, oxitetraciclina (OTC) e formalina (FOR). O dano genético foi avaliado pelo ensaio das anomalias nucleares eritrocíticas (ANE) e para clarificar a modulação da dinâmica da população eritrocítica, o índice de maturidade eritrocítica (IME) foi avaliado. A dieta suplementada com macroalgas evidenciou uma sólida genoproteção contra a genotoxicidade induzida pelos medicamentos OTC e FOR, e pelo genotóxico modelo, ciclofosfamida (CP). Além disso, OTC e FOR induziram uma instabilidade na população eritrocítica (traduzida num efeito de envelhecimento), a qual foi neutralizada pela suplementação das algas. Por seu lado, U. rigida, F. vesiculosus e duas espécies de Gracilaria, G. vermiculophylla e G. gracilis, foram individualmente avaliadas através da sua incorporação na dieta da mosca-da-fruta (Drosophila melanogaster) a 2.5 e 5%, 1.25 e 5% e 1.25 e 10% de suplementação, respetivamente. Neste ensaio, as macroalgas incorporadas foram de aquacultura ou de colheita selvagem, de forma a avaliar a influência das condições de crescimento no potencial protetor do genoma. O potencial antigenotóxico das macroalgas contra o dano genético basal e induzido pela estreptonigrina foi avaliado através do teste de mutação somática e recombinação (SMART). As macroalgas marinhas mostraram aumentar a proteção do genoma, especialmente contra o dano genético induzido pela estreptonigrina. Enquanto a U. rigida revelou diferenças no potencial antigenotóxico associadas às condições de crescimento (maior ação genoprotetora promovida pela alga de aquacultura), F. vesiculosus mostrou respostas semelhantes entre as origens. Por seu lado, a Gracilaria mostrou indicações bastante contraditórias, uma vez que o nível mais baixo de suplementação aumentou a integridade do genoma, enquanto o mais alto mostrou sinais de toxicidade, especialmente para a espécie de colheita selvagem. Além disso, no segundo ensaio com D. melanogaster, os dois lotes de U. rigida, de aquacultura e de origem selvagem (suplementação de 2.5 e 5%), confirmaram diferenças no potencial protetor do genoma, avaliado através do ensaio do cometa melhorado com a adoção das endonucleases glicosilase formamidopirimidina (FPG) e endonuclease III (EndoIII). Embora a U. rigida das duas origens tenha mostrado uma ação protetora do ADN, especialmente contra o dano genético induzido pela estreptonigrina, uma capacidade genoprotetora dependente da origem foi evidente, sendo que a alga de aquacultura demonstrou maior potencial. Isto pode ser atribuído ao perfil fitoquímico, determinado por análises de cromatografia de gás e cromatografia líquida de ultra e alta performance acopladas a espectrometria de massa, revelando diferenças na quantidade relativa de alguns fitocompostos, nomeadamente álcoois alifáticos, esteróis, sesquiterpenos e ésteres do glicerol. No ensaio com murganhos (Mus musculus), o potencial antigenotóxico das macroalgas de aquacultura U. rigida, F. vesiculosus e G. gracilis foi investigado, através dos ensaios do cometa e dos micronúcleos, considerando um consumo direto (5% de suplementação) ou uma ingestão indireta via peixe (S. aurata) (10% de suplementação) que foi previamente alimentado com uma dieta suplementada com algas. O consumo direto da mistura das macroalgas promoveu a genoproteção contra o dano genotóxico induzido pelo metanossulfonato de metilo, além de um estado pró-oxidante mais reduzido, possivelmente envolvendo substâncias desmutagénicas. Por outro lado, a hipótese relativa à transferência das propriedades genoprotetoras das macroalgas via consumo de peixe alimentado com ração suplementada com algas não se confirmou. Ainda assim, a transferência de fitocompostos das macroalgas é plausível, particularmente considerando a promoção de uma menor condição pró-oxidante. Esta tese aporta novas perspetivas acerca das propriedades benéficas das macroalgas relativamente à integridade do genoma. De facto, U. rigida, F. vesiculosus e espécies de Gracilaria demonstraram aumentar a proteção do genoma em peixe de aquacultura e em organismos-modelo para o Homem. No geral, as presentes conclusões transmitem novas evidências que poderão contribuir para o desenvolvimento das indústrias de algacultura e piscicultura, assim como para a redefinição dos hábitos nutricionais humanos, reforçando o conceito de alimento/ração funcional e subsequentes benefícios para a saúde.