Characterization of the lipid profile of Bacillus licheniformis I89 and its changes in response to the growth conditions

Abstract

Bacillus licheniformis I89 is a Gram-positive endospore-forming bacterium that has the ability to produce various compounds with biotechnological application including proteases, amylases, surfactants and antibacterial. There is no information on the lipid composition of this strain. Some published studies on B. licheniformis species report the composition in fatty acids. However, some branched fatty acids, already described in Gram positive bacteria, have also been detected and are predominant constituents of B. licheniformis I89. These branched fatty acids have been described as beneficial to human health and useful in disease prevention, and thus have potential biotechnological applications. In the present work we studied the lipidome of B. licheniformis I89. The main objectives of the study were: a) to identify the fatty acid (FA) profile of B. licheniformis strain I89 and to evaluate the adaptation of the fatty acid profile in response to the growth temperature (37 and 50ºC) and in the different growth phases (lag, exponential and stationary), b) characterize the lipidome of B. licheniformis I89 in the different phases of growth (lag, exponential and stationary) at 37 ºC and c) evaluate the effect of the antibiotic vancomycin on the alteration of the lipid composition profile of B. licheniformis I89 in the lag and exponential growth phases at 37 ° C. In order to reach the proposed objectives, gas chromatography coupled to mass spectrometry (GC-MS) was used to identify and quantify the FAs and normal phase liquid chromatography using a hydrophilic interaction column coupled to mass spectrometry (HILIC-ESI-MS) and MS/MS was used to identify the polar lipid profile. In addition, GC-MS and HILIC-ESI-MS were also used to analyze the effect of the antibiotic vancomycin on the lipid profile change. The FAs profile of B. licheniformis I89 obtained by GC-MS revealed the predominance of branched FAs of the iso and anteiso series (i-15:0, ai-15:0, i-16:0, i-17:0 e ai-17:0) and a low abundance of saturated FAs (14:0, 16:0 and 18:0) in all the growth conditions.The FA profile showed variation with temperature and also with the growth phases. From lag phase to stationary phase at 50 ° C, there was a decrease of the FAs ai-17: 0 and i-16:0, while the FA i-15: 0 increased, whereas at 37 ° C, there was an increase of FA i-15:0 and i-16: 0 and a decrease of the FA ai-15:0 and ai-17:0. On the other hand, the lipidome of B. licheniformis I89 was identified for the first time by HILIC-ESI-MS and MS/MS. In the lipidome of B. licheniformis I89, four classes of phospholipids were identified: phosphatidylethanolamine, phosphatidylglycerol, lysylphosphatidylglycerol and cardiolipin; two classes of glycolipids: monoglycosyldiglycerol and diglycosyldiglycerol; and two classes of phosphoglyceroglycolipids: mono-alanylated lipoteichoic acid primer and lipoteichoic acid primer. All lipid classes were identified in the three growth phases analyzed, with a significant increase in the lipid species with 30:0 and a significant decrease in the lipid species with 32:0, between the exponential and stationary phases, when compared to the lag phase. In addition, a change in the composition of the lipid profile of B. licheniformis I89 was observed in the presence of vancomycin in the two growth phases (lag and exponential) at 37 ° C with the reduction of the levels of some PG molecular species. Vancomycin acts at the level of inhibition of the synthesis of the cell wall. B. licheniformis I89 is sensitive to this antibiotic and therefore, it seems to affect the membrane lipids. In this particular context the lipidomic approach employed is a very promising tool to study bacterial lipid composition. Since this allows to accurately analyze changes in lipid profile in response to different growth conditions, namely, those observed in the presence of antibiotics. Branched fatty acids have been described as having antitumor activity. Considering that B. licheniformis I89 is rich in branched fatty acids, this bacterium may be used as the source of this type of FA. However, it is still necessary to investigate a possible biotechnological application of these compounds as therapeutic agents.

Bacillus licheniformis I89 é uma bactéria de Gram positivo formadora de endósporos, que possui a capacidade de produzir vários compostos de interesse biotecnológico incluindo proteases, amilases, surfactantes e antibacterianos. Não existe informação sobre a composição lipídica desta estirpe. Alguns estudos publicados sobre outras espécies B. licheniformis reportam apenas a composição em ácidos gordos. Entre os ácidos gordos identificados, estão descritos ácidos gordos ramificados, também encontrados em outras bactérias de Gram positivo. Estes ácidos gordos ramificados estão descritos como sendo benéficos para a saúde humana e úteis na prevenção de doenças, para além das potenciais aplicações biotecnológicas. Assim, o presente trabalho teve como objetivo alargar o conhecimento sobre o lipidoma de B. licheniformis I89, nomeadamente a) identificar o perfil de ácidos gordos de estirpe B. licheniformis I89 e analisar a adaptação do perfil de ácidos gordos em função da temperatura de crescimento (37 e 50 ºC) e nas diferentes fases do crescimento (lag, exponencial e estacionária), b) caracterizar o lipidoma de B. licheniformis I89 nas diferentes fases de crescimento (lag, exponencial e estacionária) a 37 ºC, c) avaliar o efeito do antibiótico vancomicina na alteração do perfil de lípidos de B. licheniformis I89, nas fases lag e exponencial de crescimento a 37 ºC. Para alcançar os objetivos propostos foram utilizadas as metodologias de cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massa (GC-MS) para identificação e quantificação de ácidos gordos e a cromatografia líquida de fase normal, usando uma coluna de interação hidrofílica, acoplada a espectrometria de massa (HILIC-ESI-MS) e MS/MS, para a identificação do perfil de lípidos polares. As mesmas metodologias foram também aplicadas para analisar o efeito de antibiótico vancomicina na alteração de perfil de lípidos da estirpe. O perfil de ácidos gordos (FAs) de B. licheniformis I89 obtido por GC-MS revelou a predominância de FAs ramificados das séries iso e anteiso (i-15:0, ai-15:0, i- 16:0, i-17:0 e ai-17:0) e menor quantidade de ácidos gordos saturados (14:0, 16:0 e 18:0) em todas as condições de crescimento. O perfil de FAs variou com a temperatura e também com as fases de crescimento. Da fase lag para a fase estacionária, a 50 ºC, houve uma diminuição dos ácidos gordos ai-17: 0 e i-16: 0, enquanto que o ácido gordo i-15: 0 aumentou. Para a temperatura de 37 ºC, observou-se um aumento dos ácidos gordos i-15: 0 e i-16: 0 e uma diminuição dos ácidos gordos ai-15: 0 e ai-17: 0. A análise do extrato lipídico por HILIC-ESIMS e MS / MS permitiu identificar o lipidoma de B. licheniformis I89, o qual ainda não tinha sido descrito até a data.No lipidoma de B. licheniformis I89 foram identificadas quatro classes de fosfolípidos: fosfatidiletanolamina, fosfatidilglicerol, lisil-fosfatidilglicerol e cardiolipina; duas classes de glicolípidos: monoglicosildiacilglicerol e diglicosildiacilglicerol; e duas classes de fosfogliceroglicolípidos: primer de ácido lipoteicóico monoalanilado e primer de ácido lipoteicóico. Todas as classes de lípidos foram identificadas nas três fases de crescimento analisadas, tendo-se observado variações na abundância em algumas espécies moleculares. Entre as fases exponencial e estacionária observou-se um aumento significativo nas espécies lipídicas 30:0 e uma diminuição significativa nas espécies lipídicas 32: 0, quando comparadas com as da fase lag. Para além disso, estudou-se ainda a alteração na composição do perfil lipídico de B. licheniformis I89 na presença de vancomicina nas duas fases de crescimento (lag e exponencial) a 37 ºC. Os resultados obtidos permitiram observar uma redução de algumas espécies moleculares de fosfatidilglicerol (PG), em resposta à presença da vancomicina. Uma vez que B. licheniformis I89 é sensível a este antibiótico, esta alteração pode ser justificada pelo facto da vancomicina atuar ao nível da inibição da síntese da parede celular podendo, por isso, afetar os lípidos que a constituem. Neste contexto, a abordagem lipidómica revelou-se uma ferramenta muito promissora no estudo da composição lipídica bacteriana, uma vez que esta permite analisar com precisão a alterações do perfil lipídico em resposta a diferentes condições de crescimento, nomeadamente, as que se observam na presença de antibióticos. Por outro lado, e dado a sua composição em ácidos gordos iso e anteiso, esta espécie de Bacillus pode vir a ser usada como fonte de ácidos gordos ramificados, uma vez que estes têm sido descritos como podendo ter atividade anti-tumoral. Muito embora essa atividade ainda tenha que ser investigada, os resultados obtidos fazem prever uma possível aplicação biotecnológica destes compostos com atividades terapêuticas.