longINg_nano: long term and multIgeNerational effects of nanomaterials in terrestrial invertebrates

Abstract

Till today, the expectations for the international market of engineered nanomaterials (NMs) are a continuous exponential grow. This is partly due to the number of applications that continues to increase. Inevitably this usage poses a risk for humans and the environment. The terrestrial compartment is at particular risk due to the presence of these materials in biosolids, remaining as a sink. Over the last decades progress has been made to improve the knowledge of NMs hazard and environmental risk assessment (ERA). Overall from the research made it was clear that results provided by most standard tests, that covered short term effects were not enough to evaluate effects of NMs. Hence data from long term exposures was urgently needed. Multigenerational exposures were highly recommended once they can provide information on post-generational and transgenerational effects. On the other hand, there was a continuously increase in the number of evidences that NMs can affect epigenetic mechanisms, and that epigenetics could help to explain multigenerational effects. So, epigenetics came as an important tool to include on the evaluation of NMs hazard and ERA. The aim of this thesis was to develop new ecotoxicity assays for the soil invertebrate standard model species Enchytraeus crypticus, to evaluate long term effects of NMs. Further it was aimed to investigate epigenetic effects, and other stress responses at different levels of biological organization, incurring from the long term exposures to NMs. Finally, it was intended to integrate all the data and build onto an adverse outcome pathway (AOP) framework. To cover long term effects, full life cycle (FLC) and multigenerational (MG) tests were developed for E. crypticus. Organisms were exposed to silver (Ag) NMs, coper oxide (CuO) NMs, Nanostructured Tungsten Carbide Cobalt (WCCo) and the corresponding ionic forms (for comparison). FLC exposures showed life stage effects which were specific for the NMs in relation to the ionic form. MG exposures showed different organisms´ responses between NMs and the ionic form, however for both forms there was transference of effects to subsequent exposed generations and unexposed generations, indicating transgenerational effects. Moreover, evaluation of epigenetic toxicity from these MG exposures was positive for both NMs and ionic form. Finally the integration of (eco)toxicoepigenetics data, at the several levels of biological organization, into the AOP framework proved to be very useful to distinguish different molecular initiating and key events, between NMs and the ionic form. In sum the research done during this thesis provided a stepping stone for the long term assessment effects of NMs in soil, and for the inclusion of evaluation of epigenetics in soil ecotoxicology.

Ainda nos dias de hoje as expectativas para o mercado internacional de nanomateriais (NMs) projectados é de um crescimento exponencial contínuo. Isto é em parte devido ao facto de que o número de aplicações para estes NMs continua a crescer. Inevitavelmente este uso acarreta risco para o ser humano e para o ambiente. Para o ambiente terrestre existe um risco acrescido devido á presença destes materiais em biossólidos, que permanecem como uma fonte de NMs. Nas últimas décadas tem-se feito progressos no sentido de melhorar o conhecimento sobre o perigo dos NMs e a avaliação do risco ambiental. Sobre a investigação realizada até então ficou claro que os resultados fornecidos pelos testes padrão, que incluíam efeitos de curta duração, não eram suficientes para avaliar os efeitos dos NMs. Assim sendo, dados sobre exposições de longa duração eram necessários urgentemente. Exposições multigeracionais eram particularmente recomendadas, uma vez que fornecem informação sobre os efeitos nas pósgerações e efeitos transgeracionais. Por outro lado, existia um aumento contínuo sobre o número de evidências que reportavam que os NMs podem afectar mecanismos de epigenética, ao mesmo tempo, a epigenética poderia ajudar a explicar os efeitos multigeracionais. Assim, a epigenética tornou-se uma ferramenta importante a incluir na avaliação do perigo e do risco ambiental dos NMs. O objectivo desta tese foi desenvolver novos ensaios de ecotoxicidade para o invertebrado de solo Enchytraeus crypticus, que é uma espécie modelo padronizada, para avaliar efeitos de longa duração dos NMs. Para além disso, tinha-se como objectivo investigar efeitos de epigenética e outras respostas gerais de stresse, nos diferentes níveis de organização biológica, que decorriam destas exposições de longa duração aos NMs. Finalmente pretendia-se também integrar todos os dados no formato de via metabólica adversa (VMA). Para a inclusão de efeitos de longa duração, testes de ciclo de vida completo (CVC) e multigeracionais (MG) foram desenvolvidos para o E. crypticus. Os organismos foram expostos a NMs de prata (Ag), NMs de óxido de cobre (CuO), carboneto de tungsténio e cobalto (WCCo) nanoestruturado e os correspondentes compostos na forma iónica (para comparação). As exposições de CVC mostraram efeitos específicos para os NMs em relação á sua forma iónica. As exposições MG mostraram diferentes respostas dos organismos para os NMs em relação á sua forma iónica, contudo para ambas as formas houve uma transferência de efeitos para as subsequentes gerações expostas e gerações não expostas, estas indicando efeitos transgeracionais. Para além disso, a avaliação da toxicidade epigenética nestas exposições MG foi positiva para os NMs e respectiva forma iónica. Finalmente a integração dos dados de (eco)toxicoepigenética, nos diferentes níveis de organização biológica, no formato de VMA, provou ser muito útil para distinguir entre NMs e a forma iónica, eventos moleculares e eventos chave. Em suma a investigação feita durante esta tese providenciou um suporte importante para a avaliação de efeitos de longa duração dos NMs no solo e, para a inclusão da avaliação epigenética na ecotoxicologia de solo.