Mechanistic approach to assess effects of nanomaterials in the environment

Abstract

Just over two decades have passed from the synthesis of engineered nanoparticles (ENPs) to their mass production. Despite this exponential growth in terms of development, application and market acceptance of ENPs, nano(eco)toxicological knowledge of potential risks have not kept the same pace. This was due, among other factors, to the vast variability of nanomaterials (NMs) and their possible combinations with the surrounding media. Certain that NMs demand will continue to increase, (eco)toxicological research should focus on the understanding of the mechanisms of novel materials and their potential impact on environment and human health. In this study, the focus of the investigation was to assess the effects of the selected NMs and to understand the mechanisms underlying the toxic responses in Enchytraeus crypticus (Oligochaeta), a relevant model species in soil ecotoxicology. Given that soil is a complex matrix due to its multifaceted nature, the challenge of understanding the toxicity of NMs is proportional to its lack of knowledge. In order to try to fill some of these gaps, the effect of two types of materials were studied in soil: silver and graphene. The first being tested on three variations of NPs (NM 300K, Ag NM and PVP - Ag NM) compared to the salt form (AgNO3) and the second, using two variations, graphene oxide (GO) and reduced graphene oxide (rGO). Through a multiparametric approach Ag was highly screened, covering all the life stages of E. crypticus, as well as different levels of biological organization, from the molecular level (gene expression), to the organismal level (hatching, survival, reproduction and avoidance). Complementarily, we study a possible alternative to reduce/reverse the toxicity caused by silver, combining Ag with substances containing thiol groups in its chain and it was compared to non-nano form. The integrated analysis of these results allowed us to realize that sub-lethal Ag concentrations for hatching tests in water, could predict long-term effects of (nano)silver materials in soil. In addition, different AgNMs induced different effects in comparison with AgNO3. Further, the successful application of the conjugation of Ag(NM) to N-acetylcysteine (NAC) and reduced glutathione (GSH) to reduce the toxic effects caused by silver is a good starting point for the nanotechnological sustainability of Ag. For graphene, it was showed that the reduced full life cycle test (rFLC) was a good indicator for predicting long-term effects, through the hatching associated with size (area) measurements of the hatched juveniles. Moreover, a distinct toxicity effect was found between GO and rGO: while GO had all the parameters evaluated significantly affected, its reduced form (rGO) was shown to have no effects. From this set of experiments, we gained better understanding of the toxicological profile of the materials tested and we learned, above all, the importance of integrative approach as well the updating/modification of standard guidelines for risk assessments of NMs. Although it was not the focus of this thesis, we also found that Enchytraeus crypticus showed to be a suitable organism as a starting point for toxicity screening of NMs, before involving in-depth studies using vertebrates.

Pouco mais de duas décadas se passaram desde o início da manipulação de nanopartículas até a sua produção em massa. No entanto, embora este crescimento tenha ocorrido exponencialmente no que respeita ao desenvolvimento, aplicação e aceitação de mercado, o conhecimento dos potenciais riscos de (eco)toxicidade não acompanharam o mesmo ritmo. Isto se deve, entre outros fatores, à vasta variabilidade de nanomateriais (NMs) e suas possíveis combinações com o meio em que se encontra. Posto isso, e dado como certo a crescente demanda dos NMs, cabe-nos tentar compreender melhor estes novos materiais, bem como o seu potencial impacto para o ambiente e saúda humana. Neste estudo, o foco de investigação foi avaliar os efeitos de NMs selecionados e entender os mecanismos subjacentes aos efeitos tóxicos em Enchytraeus crypticus (Oligoqueta), uma espécie modelo em ecotoxicologia de solo. Sendo o solo uma matriz complexa devido a sua multifacetez, o desafio de compreensão da toxicidade de NMs é proporcional à sua lacuna de conhecimento. Com o objetivo de tentar colmatar algumas destas lacunas, o efeito de dois tipos de materiais foram estudados; prata e grafeno. O primeiro foi testado utilizando três variações de NPs (NM 300K, Ag NM e PVP Ag NM) em comparação com o sal de prata (AgNO3) e o segundo, utilizando duas variações, óxido de grafeno (GO) e óxido de grafeno reduzido (rGO). Através de uma abordagem multiparamétrica Ag foi o material mais escrutinado, cobrindo todos os estágios de vida de E. crypticus, bem como diferentes níveis de organização biológica, desde o nível molecular (expressão de genes), até ao nível do organismo (eclosão, sobrevivência, reprodução e evitamento). Complementarmente, estudamos uma possível alternativa para redução/reversão da toxicidade causada pela prata, através da combinação de Ag NM300K a substâncias contendo grupos thiol em sua cadeia e em comparação com o sua forma não nano. A análise integrada destes resultados permitiu-nos perceber que concentrações sub-letais de Ag, para testes de eclosão em água, pôde prever efeitos de (nano)materiais de prata a longo prazo em solo. Além disso, AgNMs induziram efeitos distintos entre si e em comparação com o AgNO3. A aplicação bem sucedida da conjugação de Ag ao N-acetilcisteína (NAC) e a glutationa reduzida (GSH) para reduzir os efeitos tóxicos da prata é um bom ponto de partida para a sustentabilidade nanotecnológica de Ag. Para o grapheno, foi demonstrado que o teste de ciclo de vida reduzido (rFLC) mostrou ser um bom indicador para prever efeitos a longo prazo através do parametro eclosão associado a medição do tamanho (área) dos juvenis eclodidos. Ademais, distintos efeitos de toxicidade entre GO e rGO foram encontrados: enquanto que GO teve todos os parametros significativamente afetados, a sua forma reduzida (rGO) demonstrou não ter quaisquer efeitos. Com este trabalho, obtivemos uma melhor compreensão do perfil (eco)toxicólogico dos materiais testados e aprendemos, sobretudo, a importância de se usar uma abordagem multiparamétrica, bem como a atualização/modificação dos protocolos-padrão para avaliação de risco de NMs em solo. Embora não tenha sido o foco desta tese, também descobrimos que Enchytraeus crypticus pode ser um organismo adequado para uma primeira triagem da toxicidade de NMs, antes de envolver estudos mais aprofundados usando vertebrados.