Exploiting the role of long non-coding RNAs in the direct conversion of fibroblasts into functional cardiomyocytes

Abstract

Heart disease is one of the leading causes of mortality in developed countries. The associated pathology is typically characterized by the loss of cardiomyocytes that leads, eventually, to heart failure. Presently, there are many promising strategies for cardiac regeneration. Direct cardiac reprogramming is becoming known as a novel therapeutic approach to regenerate injured hearts. Direct cardiac reprogramming is a simple and quick process however, the molecular mechanisms of cardiac reprogramming and cardiomyocyte-like cells functional maturation remain to be understood. Direct cardiac reprogramming has great potential to become one of the main strategies for regenerative medicine in heart failure since fibroblasts, contrary to cardiomyocytes which do not divide, are easily available in the heart, they are a large population of cells in the heart, which become activated and turn to myofibroblasts, contributing to fibrosis after cardiac injury. Currently it is known that a specific combination of three transcription factors, Mef2c, Gata4 and Tbx5 (MGT), are enough to reprogram non-myocyte mouse heart cells into induced cardiomyocyte-like cells. Nevertheless, human fibroblasts when infected with MGT appeared to have a small percentage of conversion. With MGT retrovirus we successfully transfected: mouse adult fibroblasts (MAFs), Feeders and Gm 03348 (human fibroblasts with 10 years old). Through qPCR analysis we evaluated the expression of lncRNAs: Gm 15856, Mir22hg, Gm 027028 and Gm 28592. Our goal was to understand which lncRNAs are the best candidates to knockdown in order no enhance direct cardiac reprogramming. In addition, we studied how nutrient manipulation in cell culture media can influence direct cardiac reprogramming. It was found that media with higher levels of glucose and glutamine had larger rates of cellular survival and proliferation.

As doenças cardíacas são uma das principais causas de mortalidade nos países desenvolvidos. A patologia associada é tipicamente caracterizada pela perda de cardiomiócitos que leva, eventualmente, à insuficiência cardíaca. Atualmente, existem muitas estratégias promissoras para a regeneração cardíaca. A reprogramação cardíaca direta tem se tornado conhecida como uma nova abordagem terapêutica para regeneração cardíaca depois de uma lesão. A reprogramação cardíaca direta é um processo simples e rápido, no entanto os seus mecanismos moleculares e de maturação celular continuam maioritariamente desconhecidos. A reprogramação cardíaca direta é uma abordagem terapêutica com grande potencial para se tornar uma das principais estratégias da medicina regenerativa no combate à insuficiência cardíaca, uma vez que os fibroblastos estão facilmente disponíveis no coração e dividem-se facilmente ao contrário dos cardiomiócitos. Os fibroblastos cardíacos são uma população alargada no coração que, após uma lesão, tornam-se em miofibroblastos ativos contribuindo para a fibrose. Atualmente, sabe-se que uma combinação específica de três fatores de transcrição, Mef2c, Gata4 e Tbx5 (MGT), é suficiente para reprogramar fibroblastos cardíacos de ratinho em cardiomiócitos induzidos. Por outro lado, quando fibroblastos humanos são infetados com MGT apresentam uma pequena percentagem de conversão. Com o retrovírus MGT transfectamos com sucesso: fibroblastos adultos de ratinho (MAFs), Feeders e Gm 03348 (fibroblastos humanos com 10 anos de idade). Através da análise de qPCR, avaliamos a expressão dos lncRNAs: Gm 15856, Mir22hg, Gm 027028 e Gm 28592. O nosso objetivo foi estudar quais os lncRNAs são os melhores candidatos para knockdown, e assim melhorar a eficiência da reprogramação cardíaca direta. Para além disso, estudamos como a manipulação de nutrientes nos meios de cultura pode influenciar a reprogramação cardíaca direta. Verificou-se que meios com níveis mais altos de glucose e glutamina apresentaram maiores taxas de sobrevivência e proliferação celular.