Characterization of protein and transcript levels in amisyn mutant mice

Abstract

Amisyn is a 24 kDa protein vertebrate-specific SNARE protein known to interact with key exocytic proteins syntaxin1A, syntaxin4, SNAP25 and phospholipid PI(4,5)P2. Based on the recently published work in neuroendocrine cells and amisyn’s high expression in brain tissue, we hypothesize that this protein has a role in the negative regulation of synaptic vesicle exocytosis. Mutations in amisyn (gene name: STXBP6) have been reported in the context of several diseases like ASD (autism spectrum disorders), cancer and diabetes, which emphasized the importance of further studies. In this thesis, various experimental approaches were performed such as recombinant protein expression, liposome co-sedimentation assay, Western Blot, and quantitative PCR analyses, to advance the characterization of the amisyn protein and its possible functions. Liposome co-sedimentation assay revealed that amisyn requires phospholipid PI(4,5)P2 to bind to the membranes through its PH domain. Mutations in the amisyn’s PH domain abolished protein’s interactions with the membrane. Further, we observed that amisyn knock-out (KO) mice are viable, and we preformed systematic analysis of protein and transcript levels of various proteins related to the process of neurotransmission. This analysis revealed that the lack of amisyn leads to a decrease in VAMP2 and PSD95 protein levels and to an increase in Rab3A and α-synuclein protein levels. It was also found that the transcript levels of EndoA1, PSD95, RhoA and CAMKIV decreased and the transcript levels of Rab7 increased when amisyn was not present. Further studies are needed to fully comprehend the functions of this small SNARE protein.

A amisina é uma proteína SNARE de 24 kDa especifica de vertebrados, cujas interações com proteínas exocíticas chave sintaxina1A, sintaxina4, SNAP25 e fosfolípido PI(4,5)P2 são conhecidas. Baseado em publicações recentes em células neuroendócrinas e na elevada expressão de amisina no tecido cerebral, formulámos a hipótese de que esta proteína tem um papel na regulação negativa da exocitose de vesiculas sinápticas. Mutações na amisina (nome do gene: STXBP6) foram reportadas no contexto de algumas doenças, como TEA (transtorno do espetro autista), cancro e diabetes, o que enfatiza a importância da realização de mais estudos. Nesta dissertação, várias abordagens experimentais foram realizadas, como expressão de proteína recombinante, ensaio de co-sedimentação de lipossomas, Western Blot e análise de PCR quantitativo, para avançar a caracterização da proteína amisina e das suas possíveis funções. O ensaio de co-sedimentação de lipossomas revelou que a amisina requere o fosfolípido PI(4,5)P2 para se ligar a membranas através do seu domínio PH. Mutações no domínio PH da amisina aboliram a interação desta proteína com a membrana. Para além disso, observámos que os murganhos knock-out (KO) de amisina são viáveis, e realizámos uma análise sistemática dos níveis de proteína e de transcrição de várias proteínas relacionadas com o processo de neurotransmissão. Esta análise revelou que a falta de amisina leva a um decréscimo dos níveis das proteínas VAMP2 e PSD95 e a um aumento dos níveis das proteínas Rab3A e α-sinucleína. Também foi descoberto que os níveis de transcrição relativos à EndoA1, PSD95, RhoA e CAMKIV diminuíram e que os níveis de transcrição de Rab7 aumentaram quando a amisina não estava presente. Estudos adicionais são necessários para compreender completamente as funções desta pequena proteína SNARE.