Characterization of amisyn expression and localization in the brain over mouse lifespan

Abstract

Functionally, the nervous system is responsible for regulating behaviour and maintaining the organism homeostasis. The learning and memory processes are complex and occur in several brain areas, but mainly in the hippocampus region. Selective genes modulate these processes by coding and producing several proteins that regulate the processes of exocytosis and synaptic transmission. Guided by clues, the vesicles approach the contact points of nerve cells (synapses) and use the SNARE proteins to fuse with the plasma membrane and release neurotransmitters that stabilize the synapse and initiate synaptic transmission. Amisyn (Syntaxin-binding protein 6, STXBP6) is a protein that interacts with Syntaxin-1A (STX1A) and SNAP25 and forms nonfusogenic complexes, thus modulating the formation of SNARE complexes and inhibiting exocytosis. Many studies have focused on the molecular and cellular understanding of the processes that promote neuronal exocytosis. However, proteins like amisyn that inhibit neuronal exocytosis have still not been explored extensively. In this study, the cerebral anatomic location of amisyn was investigated as well as its expression and protein quantification throughout the neuronal development of healthy mice. This was done by Western blotting, where the expression of amisyn and other proteins involved in the formation of the SNARE complex, present in samples of mice from different stages of development (embryo, young, adult and elderly), were analyzed. The results showed a significant difference at various time-points in the brain in terms of relative amounts of amisyn and SNARE proteins. To describe their location in the brain structures, immunohistochemical analysis and colocalization with pre- and postsynaptic proteins were performed, which revealed a higher concentration of this protein in the hippocampus area and prominent colocalization values with postsynaptic markers. These results provide a better understanding of the developmental phase of the mouse brain and suggest that amisyn decline begins during normal mouse aging. The difference observed between the various proteins reveals that their level changes in different phases during the mouse development. Together, these results provide more knowledge about neuronal aging and the possible role of amisyn in neuronal synapses in age-related changes.

Funcionalmente, o sistema nervoso é responsável por regular o comportamento e por manter a homeostasia do organismo. Os processos de aprendizagem e memória são complexos e ocorrem em diversas zonas cerebrais, mas principalmente na região do hipocampo. Estes processos são regulados por um grupo de genes que determina a expressão de proteínas, que por sua vez regulam os processos de exocitose e transmissão sináptica. Orientadas inicialmente por sinais neuroquímicos, as vesículas presentes nos pontos de contacto das células nervosas utilizam proteínas SNARE para se fundirem com a membrana plasmática e libertarem neurotransmissores que iniciam a transmissão sináptica e a longo-termo estabilizam a sinapse. A amisina (Proteína 6 de ligação à sintaxina, STXBP6) é uma proteína que interage com Sintaxina 1 (STX1A) e SNAP25 e forma complexos não fusogénicos modulando, desta forma, a formação de complexos SNARE e inibindo a exocitose. Muitos estudos têm-se focado na compreensão molecular e celular dos processos que promovem a exocitose neuronal. No entanto, as proteínas como a amisina que inibem a exocitose neuronal ainda não foram explorados extensivamente. Neste estudo, foi investigada a localização anatómica cerebral da amisina, bem como a sua expressão e quantificação proteica ao longo do desenvolvimento neuronal de ratinhos saudáveis. Através de Western blotting, foi analisada a expressão da amisyn e proteínas envolvidas na formação do complexo SNARE, presentes em amostras de ratinhos de diferentes estágios de desenvolvimento (embrionário, jovem, adulto e idoso). Os resultados mostraram uma diferença significativa entre ratinhos com 1 mês de idade e ratinhos de 24 meses de idade no cérebro em termos de quantidades relativas das proteínas amisyn e proteínas SNARE no cérebro. Para descrever a sua localização nas estruturas cerebrais recorreu-se a análise de imuno-histoquimica e colocalização com proteínas pré- e póssinápticas, que revelaram maior concentração da proteína na região do hipocampo e maiores valores de sobreposição com marcadores póssinápticos. Estes resultados proporcionam uma maior compreensão da fase de desenvolvimento em que se inicia o declínio da amisina durante o envelhecimento normal do rato. A diferença observada entre as outras proteínas testadas revela que a sua função se altera em fases diferentes. Estes resultados fornecem mais conhecimento sobre o envelhecimento neuronal e possível papel da amisina nas sinapses neuronais em alterações relacionadas com a idade.