Ecotoxicological assessment of PAHs using the freshwater planarian Girardia tigrina

Abstract

Freshwater planarians are animals that possess a set of features that has made them pivotal for research areas such as stem cell research, neurophar-macology, or ageing research. The appeal of these animals has stemmed from features such as the existence of adult stem cells distributed over their bodies, the presence of a simple brain sharing similarities with the vertebrate nervous system, or their apparent lack of ageing. The interest in freshwater planarians as experimental animals has spread to ecotoxicity testing, given features such as easy maintenance in laboratory setting, their sensitivity to environmental contaminants, and also the range of effects that can be evaluated in response to contaminants, such as teratogenicity, carcinogenicity, reproductive and be-havioural toxicity or neurotoxicity. Their predatory nature offers yet another interesting opportunity to include them in multi-species tests as epibenthic in-vertebrate predators. In the context of exploring the sensitivity of freshwater planarian endpoints to environmental contaminants, the present work used polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) as model compounds. PAHs are ubiquitous contaminants in the environment, given the multitude of natural and anthropogenic sources and their ability to be transported over long distances through the air. As a major contaminant class in the environment, the risk as-sessment of PAHs has been challenging, given the array of metabolizing abili-ties among invertebrates, as well as the multitude of effects these compounds can elicit. For some invertebrate groups, such as freshwater planarians, there is virtually no (eco)toxicological information. With the ultimate goal of exploring freshwater planarians in the context of ecotoxicological research, this work used the freshwater Girardia tigrina as experimental animal and three PAHs with distinct number of aromatic rings, the 3-, 4- and 5-ringed phenanthrene, pyrene and benzo[a]pyrene, respectively. Several specific objectives were ad-dressed: development of novel planarian bioassays, evaluation of PAH toxicity potential accumulation in G. tigrina under different exposure scenarios. Along 6 experimental chapters, experimental protocols were refined and, more specifi-cally, a feeding protocol was developed in accordance with the specific features of G. tigrina. This freshwater planarian was also shown to be sensitive to PAHs, with mortality, disintegration of tissues, regeneration delays, behavioural impairments, biochemical changes, decreases in reproductive output and de-creased newborn fitness being observed: The severity of effects was well relat-ed with the concentration-dependent increase of PAH-type compounds in pla-narian tissues. However, despite chemical similarities, each PAH elicited differ-ent effects in planarians. The evaluation of feeding and locomotion in response to chemical stress was evidenced to be sensitive at short exposure periods, showcasing the potentialities of planarian behavioural endpoints for ecotoxicity testing. With longer exposure periods, fecundity was shown to be a sensitive endpoint, while increased behavioural anomalies in unexposed newborns re-sulting from B[a]P-exposed parents, evidenced the importance of newborn condition as a reproduction-related endpoint in planarians and for transgenera-tional studies. The evaluation of internal concentrations of PAH-type com-pounds in the head and tail portions of exposed planarians revealed that these compounds accumulated more in the heads of planarians, providing a hint on the potential neurotoxicity of these compounds, as suggested by the observed behavioural effects. Moreover, the accumulation of PAH-type compounds in G. tigrina exposed to B[a]P-contaminated sediments or to contaminated prey, evidenced their potential for ecotoxicological experiments with contaminated sediments and to evaluate trophic transfer of contaminants. The results ob-tained in the present work indicate that planarians are sensitive to chemical stress, with a multitude of available endpoints, while showing potential for in-clusion as invertebrate predators in multispecies studies as invertebrate preda-tors. Therefore, their usage for ecotoxicological research is strongly recom-mended.

As planárias de água doce são animais que possuem uma variedade de carac-terísticas que as tornou fundamentais para várias áreas do conhecimento, tais como a investigação em células estaminais, a neurofarmacologia ou a investi-gação sobre envelhecimento. O interesse por estes animais deve-se a atributos únicos como a existência de células estaminais distribuídas pelos seus corpos, a presença de um cérebro simples, mas com semelhanças ao sistema nervoso dos vertebrados, ou a sua aparente ausência de envelhecimento. O interesse pelas planárias como animais experimentais difundiu-se à área da investigação ecotoxicológica, não só devido à sua fácil manutenção em contexto laboratorial e sensibilidade a contaminantes ambientais, mas também à vasta gama de respostas que podem ser usadas para avaliar a teratogénese, a carcinogénese, a toxicidade comportamental e reprodutiva ou a neurotoxicidade. Para além disto, as planárias podem ser usadas em testes com múltiplas espécies como invertebrados epibentónicos predadores. Neste contexto, o presente trabalho pretendeu explorar os parâmetros ecotoxicológicos das planárias de água doce em resposta a contaminantes ambientais, através da utilização de hidrocarbo-netos aromáticos policíclicos (PAHs) como compostos modelo. Os PAHs são contaminantes ubíquos no ambiente, devido à variedade de fontes emissoras, tanto naturais, como antropogénicas, e à sua capacidade de serem transporta-dos através do ar por longas distâncias. Contudo, a avaliação de risco ambien-tal dos PAHs tem-se mostrado difícil, devido à variabilidade das capacidades de metabolização destes compostos nos invertebrados e à grande variedade de efeitos que os PAHs podem provocar nos organismos. Para alguns grupos de invertebrados, como é o caso das planárias, os efeitos destes compostos são (quase) desconhecidos. No sentido de explorar a potencial utilização das planá-rias de água doce no contexto da ecotoxicologia, este trabalho utilizou a espé-cie Girardia tigrina como organismo modelo e três PAHs com diferentes núme-ros de anéis aromáticos, o fenantreno, o pireno e o benzo[a]pireno (B[a]P), de 3, 4 e 5 anéis aromáticos, respetivamente. Foram delineados vários objetivos específicos: o desenvolvimento de ensaios para a avaliação dos parâmetros ecotoxicológicos nas planárias de água doce, a avaliação da toxicidade dos PAHs e a potencial acumulação dos PAHs em diferentes cenários de exposi-ção. Ao longo de 6 capítulos experimentais, os protocolos para a avaliação dos parâmetros ecotoxicológicos foram refinados e, mais especificamente, foi de-senvolvido um protocolo para avaliar a inibição alimentar de acordo com as características específicas da planária G. tigrina. Também se verificou que esta espécie de planária é sensível aos PAHs, tendo sido observada mortalidade, desintegração de tecidos, atrasos na regeneração, alterações comportamen-tais, alterações bioquímicas, diminuição da taxa reprodutiva e efeitos em planá-rias recém-nascidas. A severidade dos efeitos observados aumentou de acordo com as concentrações internas de PAHs nos tecidos das planárias. No entanto, apesar das semelhanças químicas entre os compostos, cada um dos PAHs provocou diferentes efeitos nas planárias. A avaliação da taxa de alimentação e locomoção mostrou ser sensível em resposta aos contaminantes em exposi-ções de curta duração, e evidenciou o potencial destes parâmetros para a ava-liação ecotoxicológica. Em períodos de exposição mais longos, a fecundidade mostrou ser um parâmetro sensível. Para além disso, através da observação dos recém-nascidos resultantes de progenitores expostos ao B[a]P, foi verifica-do que estes apresentavam anomalias comportamentais, evidenciando, assim, a importância da avaliação da condição dos recém-nascidos como um parâme-tro reprodutivo e em exposições multigeracionais. Constatou-se ainda que, nos tecidos das planárias, os PAHs se acumularam em maior quantidade na zona cefálica, potencialmente indicando que estes compostos poderão ser neurotóxi-cos para as planárias, como sugerem também as alterações comportamentais. Para além disto, a bioacumulação de PAHs em planárias expostas a sedimen-tos contaminados ou que consumiram presas contaminadas com B[a]P, de-monstrou o potencial destes animais para testes de avaliação ecotoxicológica de sedimentos e na avaliação da transferência trófica de contaminantes. Os resultados obtidos no presente trabalho indicam que as planárias são sensíveis a contaminantes, permitem a avaliação de uma grande variedade de parâme-tros e podem também ser usadas como predadores em testes com múltiplas espécies. Assim, a utilização das planárias de água doce para a investigação ecotoxicológica é fortemente recomendada.