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Title: Thermal tolerance and acclimation capacity of the ragworm Hediste diversicolor under global change scenarios
Other Titles: Tolerância térmica e capacidade de aclimatação da serradela Hediste diversicolor às alterações globais
Author: Fernandes, Joana Filipa da Cunha
Advisor: Madeira, Diana Sofia Gusmão Coito
Calado, Jorge
Keywords: Multiple stressors
Thermal limits
Energy allocation
Defense Date: Dec-2019
Abstract: Climate projections predict significant changes in ocean chemistry, salinity variations and the increase in ocean temperature by 2100. This has led to a substantial interest in the study of thermal ecophysiology, as temperature is a major factor shaping marine communities. Considering that most marine species are ectotherms, and thus cannot regulate body temperature, biochemical changes can occur with temperature variations. Moreover, salinity fluctuations can also induce physiological and metabolic changes in marine organisms. In this study, we experimentally evaluated the physiological and molecular responses of the ragworm Hediste diversicolor under predicted global change scenarios. Organisms were collected from the intertidal zone in Ria de Aveiro (Portugal) and subjected to an experimental trial under control (24 °C), and two treatment scenarios (ocean warming +3 ºC - 27°C and heat wave +6 ºC - 30°C) predicted by the Intergovernmental Panel on Climate Change, combined with salinity variations (20 and 30) in full factorial design. Environmental data (temperature, salinity and pH were collected during 60 days in the summer. Organisms were subjected an experimental acclimation trial during 29 days, and after 14 and 28 days of acclimation (D14 and D28 respectively), individuals were sampled (per time point) for molecular biomarkers analyses (heat shock protein 70kDa, ubiquitin, catalase, glutathione-S-transferase, superoxide dismutase activity, total antioxidant capacity, lipid peroxidation and glucose), fatty acid profiles and energy reserves (total protein, total lipid and glycogen content). At day 30, upper thermal limits (Critical Thermal Maximum - CTMax), thermal safety margins (TSM) and acclimation capacity were measured. In situ data collection, showed that H. diversicolor experiences wide temperature variations, but salinity showed no considerable variations during the sampling period. Higher acclimation temperatures led to higher thermal tolerance limits, confirming that H. diversicolor has some physiological plasticity, acclimation capacity and a positive thermal safety margin (CTMax > maximum habitat temperature – MHT). For biomarkers, the significant interaction of the three factors (temperature, salinity and day) indicates that the effect of one factor depends on the levels of the others factors. Particularly, significant temperature-salinity-time interactions were recorded for Hsp70, Ub and CAT, and all biomarkers except Ub were significant in factor day. The biomarkers that contributed most to the separation of the experimental treatments were glucose, glutathione S-transferase, ubiquitin, Hsp70 and catalase, and the differences between temperatures were more evident and prolonged when combined with low salinity. This suggests that glucose was mobilized to produce energy for cellular defenses, and antioxidant enzymes, ubiquitin and heat shock protein played an important role during hypo-osmotic and thermal stress, protecting cells from the toxic effects of reactive oxygen species (ROS) and managing the integrity of the protein pool, thereby allowing the proper management of cellular functioning. For the fatty acids (FA), the major saturated fatty acid (SFA) was palmitic acid (16:0), the dominant monounsaturated fatty acid (MUFA) was vaccenic acid (18:1n-7), in the polyunsaturated fatty acids (PUFA) the most abundant FA was linoleic acid (18:2n-6) and eicosapentaenoic acid (EPA) (20:5n-3) was the FA with the highest value between all of the highly unsaturated fatty acids (HUFA). An increase in the different fatty acid classes was observed, as well as in Σn-3 PUFA, Σn-6 PUFA and in essential fatty acids over time in polychaetes exposed to salinity 30, contrary to what was observed in salinity 20. These results suggest that salinity 30 is an optimal condition for H. diversicolor, favoring its physiological condition. Temperature also significantly influenced fatty acids, interacting with salinity. At 14 days of exposure, under optimal salinity conditions (30), there was an increase in HUFA from 24 °C to 27 °C, followed by a decrease at 30 °C. Omega 3 and 6 fatty acids remained stable at 24 ºC and 27 ºC, with a decrease detected at 30 ºC. These decreases may relate to changes in the lipid composition of cell membranes in order to maintain homeostasis. At 28 days there were no differences, suggesting that polychaetes can acclimate to elevated temperatures when they are in optimal salinity conditions. If the temperature increase occurs under low salinity conditions (20), changes in fatty acids are more pronounced, with an increase in all fatty acid classes after 14 days of exposure to 27 °C and 30 °C, comparing with the control (24 °C). At 28 days, the difference remains only in HUFA. In general, when polychaetes are grown at low salinity, a moderate increase in temperature causes Σn-3 PUFA, Σn-6 PUFA, ARA, EPA and DHA fatty acids to increase. However, if the temperature increase is more extreme (30 °C), the concentrations of these fatty acids decrease, following the expected pattern. These results indicate that fatty acids may be important in providing energy (especially saturated ones) and may play an important role in osmotic balance and membrane fluidity (especially unsaturated ones). Energy reserves, namely lipids and glycogen were not significantly affected by the time of exposure to treatments. Since the organisms had glucose available for energy, they did not need to degrade the carbohydrate, keeping their energetic reserves. However, there was an increase of total protein over time in the treatments at 27 ºC, in both salinities, suggesting some growth of the polychaetes under this temperature during the month of the experimental trial. There was also a decrease in total lipids at 27 °C, potentially due to lipid mobilization to provide energy for protein synthesis. The main conclusion is that H. diversicolor can easily acclimate to increased water temperature and salinity fluctuations. Even when organisms are adapted to tolerate these extreme environments and populations are able to persist, the environmental variability characteristic of estuaries is potentially stressful to animals inhabiting these conditions, leading to certain molecular mechanisms being activated to maintain homeostasis. Future studies on the current topic are therefore needed in order to evaluate the physiological plasticity of organisms to new global change conditions. Moreover, longer experimental trials are necessary, including all life-cycle stages, as well as trans-generational experiments and the integration of physiology into ecological modelling, in order to identify vulnerable life stages, and detect changes at higher levels of biological complexity and on an evolutionary scale.
As projeções climáticas preveem mudanças significativas na química do oceano, variações de salinidade, assim como um aumento na sua temperatura até 2100. Isso levou a um interesse substancial no estudo da ecofisiologia térmica, pois a temperatura é um fator importante para moldar as comunidades de organismos marinhos. Considerando que a maioria das espécies marinhas são ectotérmicas e, portanto, não podem regular a temperatura do seu corpo, poderão ocorrer alterações bioquímicas com as variações de temperatura no ambiente. Além disso, as variações da salinidade também podem induzir alterações fisiológicas e metabólicas nos organismos marinhos. Neste estudo, avaliamos experimentalmente as respostas fisiológicas e moleculares do poliqueta Hediste diversicolor sob cenários previstos de alterações globais. Os organismos foram amostrados da zona intertidal da Ria de Aveiro (Portugal) e submetidos a um ensaio experimental em condições de controlo (24 °C), e dois cenários de tratamento (aquecimento do oceano +3 ºC - 27 °C e onda de calor +6 ºC - 30 °C) previsto pelo Painel Intergovernamental para as Alterações Climáticas, combinado com variações de salinidade (20 e 30) de forma fatorial. Os dados ambientais (temperatura, salinidade e pH) foram monitorizados durante 60 dias. Os organismos foram submetidos a um ensaio experimental de aclimatação durante 29 dias e, após 14 e 28 dias de aclimatação (D14 e D28, respetivamente), os indivíduos foram amostrados, para quantificação de: biomarcadores moleculares (proteína de choque térmico 70kDa, ubiquitina, atividade de catálase, glutationa-S-transferase, e superóxido dismutase, capacidade antioxidante total, peroxidação lipídica e glicose), perfis de ácidos gordos e as suas respetivas classes e reservas energéticas (proteína total, lípido total e conteúdo de glicogénio). No dia 30, foram medidos os limites térmicos (máximo térmico crítico - CTMax), margens de segurança térmica (TSM) e capacidade de aclimatação. Os dados ambientais in situ revelaram que a espécie H. diversicolor está sujeita a variações de temperatura amplas, sendo que a salinidade não apresentou variações consideráveis durante o período de amostragem. As temperaturas mais altas de aclimatação promoveram limites de tolerância térmica mais altos, confirmando que H. diversicolor possui alguma plasticidade fisiológica, capacidade de aclimatação e uma margem de segurança térmica positiva (CTMax > temperatura máxima do habitat - MHT). Esta plasticidade ajuda os organismos a serem mais tolerantes a uma mudança repentina na temperatura da água. Para os biomarcadores, a interação significativa dos três fatores (temperatura, salinidade e dia) indica que os efeitos de cada fator estão dependentes dos níveis dos outros fatores. Particularmente, as interações significativas entre temperatura, salinidade e dia foram registadas para a Hsp70, ubiquitina e catálase. Todos os biomarcadores, exceto a ubiquitina, foram significativos no fator dia. Os biomarcadores que mais contribuíram para a separação dos tratamentos experimentais foram a glicose, glutationa S-transferase, ubiquitina, Hsp70 e catálase, sendo que as diferenças entre temperaturas foram mais evidentes e prolongadas quando combinadas com baixa salinidade. Este resultado sugere que a glicose foi mobilizada para produzir energia para as defesas celulares, sendo que as enzimas antioxidantes, a ubiquitina e proteína de choque térmico desempenharam um papel importante durante o stress térmico e hipo-osmótico, protegendo as células dos efeitos tóxicos das espécies reativas de oxigénio (ROS) e, controlando a integridade das proteínas, permitindo um adequado funcionamento celular. Relativamente aos perfis de ácidos gordos, o mais abundante dos saturados (SFA) foi o ácido palmítico (16:0), nos monoinsaturados (MUFA) foi o ácido vacênico (18:1n-7), nos polinsaturados (PUFA) o ácido linoléico (18:2n-6) e o ácido eicosapentaenóico (20:5n-3) nos altamente insaturados (HUFA). Observou-se um aumento nas várias classes de ácidos gordos, assim como nos Σn-3 PUFA, Σn-6 PUFA e ácidos gordos essenciais ao longo do tempo nos poliquetas expostos a salinidade 30, ao contrário do que se observou na salinidade 20. Estes resultados sugerem que a salinidade 30 representa uma condição ambiental preferencial para a espécie H. diversicolor, favorecendo a sua condição fisiológica. A temperatura também influenciou significativamente o perfil de ácidos gordos, interagindo com a salinidade. Aos 14 dias de exposição, em condições preferenciais de salinidade (30), verificou-se um aumento nos HUFA dos 24 ºC para os 27 ºC, seguido de um decréscimo aos 30 ºC. Os ácidos gordos ómega 3 e 6 mantiveram-se estáveis a 24 ºC e 27 ºC, sendo detetado um decréscimo a 30 ºC. Estas diminuições poderão estar relacionadas com alterações na composição lipídica das membranas celulares, de forma a manter a homeostasia. Aos 28 dias não se verificaram diferenças, sugerindo que os poliquetas terão conseguido aclimatar-se às temperaturas elevadas quando estão em condições preferenciais de salinidade. Um aumento de temperatura em condições de baixa salinidade (20) promove alterações mais pronunciadas no perfil de ácidos gordos, tendo sido registado um aumento em todas as classes destas moléculas após 14 dias de exposição a 27 ºC e 30 ºC, quando comparado com o controlo (24 ºC). Aos 28 dias, esta diferença é apenas percetível nos HUFA. No geral, quando os poliquetas são cultivados a baixa salinidade, um aumento moderado de temperatura leva a que os ácidos gordos Σn-3 PUFA, Σn-6 PUFA, ARA, EPA e DHA aumentem. No entanto, se o aumento de temperatura for mais extremo (30 ºC), as concentrações destes ácidos gordos diminuem, seguindo o padrão esperado. Estes resultados confirmam a importância dos ácidos gordos na provisão de energia (especialmente os saturados), assim como no balanço osmótico e fluidez da membrana (especialmente os insaturados). As reservas de energia, nomeadamente os lípidos e o glicogénio não foram significativamente afetadas pelo tempo de exposição aos diferentes tratamentos experimentais. A disponibilidade de glicose para obtenção de energia, evitou a degradação do hidrato de carbono, sendo assim possível os poliquetas manterem as suas reservas energéticas. No entanto, foi verificado um aumento de proteína total ao longo do tempo nos tratamentos a 27 ºC, em ambas as salinidades, sugerindo um crescimento dos poliquetas nessa temperatura durante o mês do ensaio experimental. Verificou-se também uma diminuição dos lípidos totais a 27 ºC, potencialmente devido a uma mobilização dos lípidos para providenciar energia para a síntese de proteínas. Em conclusão, pode afirmar-se que a poliqueta H. diversicolor pode aclimatar-se facilmente ao aumento da temperatura da água e a variações de salinidade. Mesmo quando os organismos estão adaptados para tolerar esses ambientes extremos e as populações são capazes de persistir, a típica variabilidade ambiental dos estuários é potencialmente stressante para os animais que habitam essas condições, levando a que certos mecanismos moleculares sejam ativados para manter a homeostasia. Futuramente será necessário desenvolver ensaios experimentais mais longos que, incluam todas as etapas do ciclo de vida deste poliqueta e, contemplem igualmente os aspetos transgeracionais, assim como é necessária a integração dos aspetos fisiológicos na modelação ecológica de modo a permitir detetar as fases de desenvolvimento mais vulneráveis, assim como alterações em níveis mais altos de complexidade biológica e numa escala evolutiva.
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