Characterization of the nuclear envelope alterations in Myotonic Dystrophy Type 1

Abstract

The myotonic dystrophy type 1 (DM1) is a multisystem genetic disorder mainly associated with degeneration of skeletal muscle and caused by a CTG repeat expansion in the 3′ untranslated region of the DMPK gene, accumulating as nuclear foci and compromising the nuclear function. In the last few years, some studies associate nuclear envelope proteins as a significant component in the response of cells to mechanical stress, helping to maintain muscle cell integrity, demonstrating a clear association to DM1 pathology. In fact, it has been demonstrated that DM1 patient’s fibroblasts presents an impaired nuclear structure and an altered localization of some NE proteins. However, the contribution of the NE for DM1 was not fully elucidated. In this work, we performed an ATR-FTIR spectroscopy study of human control and DM1 fibroblasts to identify spectral differences. The human patients’ fibroblasts included in this study have 1000 CTG and 2000 CTG repeats, representing the adult and congenital DM1 types, respectively. DM1 fibroblasts present differences at the molecular level, mainly in protein and lipids structures: DM1 donors can be distinguished from controls by a larger lipidic stretching, more saturated lipidic stretching and presence of protein aggregates. These differences can be explained by the dysregulation of lipins in DM1, affecting the lipid metabolism, and RNA and polyglutamine expansion proteins accumulation as nuclear aggregates, respectively. Moreover, the nuclear profile in human fibroblasts derived from DM1 patients was evaluated, in order to characterize some particular nuclear features, namely the nuclear area, circularity, deformations (blebs and misshaped nuclei) and micronucleus presence. Our results evidenced a tendency to increase the nuclear area, the number of cells with micronuclei and the % of deformed nuclei in DM1 donors, comparing to the control. Further, in order to unravel some nuclear envelope proteins alterations in DM1, namely in lamin A/C, emerin, SUN1 and LAP1, we performed immunocytochemistry analysis in human fibroblasts. Regarding lamin A/C, emerin and LAP1, these proteins showed an altered localization in nuclear envelope, in both DM1 fibroblasts. Also, both lamin A/C and emerin are highly present in protein positive-nuclear inclusions whereas SUN1 and LAP1 are highly present in protein positive-nuclear invaginations. To conclude, spectral differences have been identified between controls and DM1 fibroblasts. Moreover, the nuclear architecture and nuclear envelope proteins seems to be altered in DM1 donors. Therefore, further studies should be performed in order to elucidate nuclear envelope proteins contribution to the disease.

A distrofia miotónica tipo 1 (DM1) é uma disfunção genética multissistémica associada principalmente à degeneração do músculo esquelético e causada por uma expansão repetida de trinucleótidos CTG na região 3' não traduzida do gene DMPK, acumulando-se na forma de inclusões nucleares e comprometendo a função nuclear. Nos últimos anos, alguns estudos associaram algumas proteínas do envelope nuclear (NE) como sendo componentes importantes na resposta das células ao stress mecânico, ajudando a manter a integridade das células musculares, o que demonstra uma associação com a DM1. De facto, já foi demonstrado que os fibroblastos de pacientes com DM1 apresentavam uma estrutura nuclear comprometida e uma localização alterada de algumas proteínas do NE. No entanto, a contribuição que o envelope nuclear possa ter para a DM1 ainda não foi totalmente elucidada. Neste trabalho, realizámos um estudo espectroscópico ATR-FTIR usando fibroblastos humanos de controlos e de pacientes com DM1 de forma a identificar diferenças espectrais. Os fibroblastos dos pacientes incluídos neste estudo têm 1000 repetições de CTG e 2000 repetições de CTG, representando os tipos DM1 adulto e congénito, respectivamente desta doença. Os modelos de DM1 usados neste estudo apresentaram diferenças a nível molecular, principalmente nas estruturas das proteínas e dos lipídos: os modelos de DM1 podem ser diferenciados dos controlos através de cadeias lipídicas maiores, cadeias lipídicas mais saturadas e presença de agregados proteicos. Estas diferenças podem ser explicadas por um metabolismo lipídico alterado e pela acumulação de agregados tóxicos sob a forma de RNA e de proteínas de poliglutaminas expandidas. Além disso, foi avaliado o perfil nuclear em fibroblastos humanos de controlos e de pacientes com DM1, de forma a caracterizar algumas características nucleares específicas, nomeadamente: área nuclear, circularidade, deformações (blebs e núcleos irregulares) e presença de micronúcleos. Os nossos resultados evidenciaram uma tendência para a área nuclear, o número de células com micronúcleos e os núcleos deformados aumentarem nos modelos de DM1, em comparação aos controlos. Além disso, para observar a localização de algumas proteínas do envelope nuclear, nomeadamente, lamina A/C, emerina, SUN1 e LAP1, foi realizada uma análise imunocitoquímica nos fibroblastos humanos de controlos e de pacientes com DM1. Em relação à lamina A/C, emerina e LAP1, estas proteínas apresentaram uma localização alterada no envelope nuclear em ambos os modelos de DM1 (DM1 1000 e DM1 2000). Além disso, a lamina A/C e a emerina mostraram estar acumuladas nas inclusões nucleares marcadas por estas proteínas, enquanto que a SUN1 e a LAP1 mostraram estar acumuladas nas invaginações nucleares marcadas por estas proteínas. Para concluir, foram identificadas diferenças espectrais entre os controlos e os modelos de DM1. Além disso, a arquitetura nuclear e as proteínas do envelope nuclear mostraram estar alteradas nos modelos de DM1. Portanto, mais estudos devem ser realizados para elucidar a contribuição que as proteínas do envelope nuclear possam ter para esta doença.