Pathogenic and antibiotic -resistant strains of Escherichia coli in wastewater effluents treated with UV radiation

Abstract

Antibiotic resistance jeopardizes the treatment of bacterial infections worldwide, with clinical and environmental compartments being recognized in its pandemic dissemination. Wastewater Treatment Plants (WWTPs) are notorious sources of antibiotic resistance into the aquatic systems and are thus considered a key node for containing the antibiotic resistance dissemination across the humanenvironmental microbiota axis. In this extent, disinfection of effluents before their discharge (e.g. by UV-C irradiation) is a promising strategy. However, some clinically relevant bacteria have been shown to survive such disinfection steps, though a knowledge gap exists in what regards their phenotypic and genotypic features. In this study we characterized a collection of clinically relevant extended-spectrum beta-lactamase-producing Escherichia coli isolated from an WWTP’s UV-C-irradiated effluent, aiming to identify putative human health risks associated with such effluents. Twenty-five strains of antibiotic-resistant, CTX-M-producing E. coli were genotyped (rep-PCR, Pulsed-Field Gel Electrophoresis, Multilocus Sequence Typing and Clermont phylogrouping), antibiotic-resistant genes (ARGs) and virulence genes (VGs) were PCR-detected, plasmids were analysed by enzymatic restriction and conjugal transfer was evaluated by mating assays. Biofilm, siderophore and haemolysin production, cytotoxicity and invasion into Vero cells and infection of Galleria mellonella larvae were phenotypically assessed. Illumina whole-genome sequencing and evaluation of persistence in freshwater microcosms was performed for 6 selected strains. Analysis of rep-PCR profiles separated strains into 2 major groups, including strains affiliated either with phylogroup B2-sgI (n=7 isolates) or with phylogroups A (n=16) and C (n=2); and further separated into 8 known STs, namely B2:ST131 (n=7), A:ST58 (n=1), A:ST155 (n=4), C:ST410 (n=2), A:ST453 (n=2), A:ST617 (n=2), A:ST744 (n=1) and A:ST1284 (n=3). Of 18 PCR-screened ARGs, 9 were detected (i.e. sul1, sul2, sul3, tet(A), tet(B), blaOXA-1-like, aacA4, aacA4-cr and qnrS1). No VGs were identified by PCR. Plasmid restriction indicated high diversity of plasmid profiles among strains and mating assays yielded cefotaxime-resistant transconjugants for 8 strains, two of which displaying a multi-drug resistant (MDR) phenotype. All strains were classified as cytotoxic (9 significantly more cytotoxic than the positive control), 10 of 21 strains were invasive (particularly B2:ST131 strains) and 10 selected isolates were pathogenic to larvae. Twenty-four and 7 of the 25 strains produced siderophores and haemolysins, respectively. Approximately 65% of the tested strains formed biofilms, 11 in two distinct experimental conditions. Genome analysis identified additional ARGs (e.g. catB3, strA, strB) and several VGs encoding toxins, siderophores, and colonizing, adhesion and invasion factors. Four of 6 strains were still detected by cultivation and/or qPCR after 28 days of incubation in freshwater microcosms, and resistance phenotypes remained unaltered. In this study, we confirmed WWTP’s UV-C-treated outflow as an input source of MDR and/or virulent E. coli strains, some probably capable of persisting in freshwater, and carrying conjugative antibiotic resistance plasmids. Hence, UVdisinfected wastewater may still represent a risk for human health and antibiotic stewardship, which implies a lack of efficiency of this treatment to remove pathogens from wastewater, compromising water reuse. More detailed evaluation of strains isolated from other wastewater effluents is urgent, in order to design new treatments or establish synergistic combinations that can mitigate the release of such bacteria into the environment.

A resistência a antibióticos compromete o tratamento de infecções bacterianas a nível mundial, sendo reconhecido o papel dos reservatórios clínicos e ambientais na sua disseminação. As Estações de Tratamentos de Águas Residuais (ETAR) são fontes de contaminação dos sistemas aquáticos com bactérias resistentes a antibióticos e genes de resistência. Por esta razão são consideradas nodos importantes onde pode ser contida a transferência de resistência no eixo microbiota humano-ambiental. A desinfecção dos efluentes tratados (e.g. por irradiação com UV-C) é uma estratégia promissora. No entanto, algumas bactérias de relevância clínica sobrevivem à desinfeção, desconhecendo-se as suas características fenotípicas e genotípicas. Neste estudo, caracterizámos estirpes de Escherichia coli produtoras de betalactamases de espectro alargado isoladas de um efluente tratado com radiação UV-C, com o objetivo de identificar potenciais riscos para a saúde humana associados a estes efluentes. Vinte e cinco estirpes de E. coli resistentes a antibióticos e produtoras de CTXM foram submetidas a genotipagem por rep-PCR, eletroforese em campo pulsado, sequenciação de múltiplos loci e determinação de filogrupos. Genes de resistência a antibióticos (GRAs) e genes de virulência (GV) foram detectados por PCR. Os plasmídeos foram analizados por restrição enzimática e a sua transferência avaliada por ensaios de conjugação. A produção de biofilmes, sideróforos e hemolisinas foi determinada fenotipicamente. Foi também avaliada a citoxicidade e invasão celular, usando células Vero, e a infecção de larvas de Galleria mellonella. Os genomas de 6 estirpes foram sequenciados e a sua persistência em água doce foi avaliada em microcosmos. A análise dos perfis de rep-PCR separou as estirpes em 2 grupos: 1) estirpes do filogrupo B2-sgI (n=7 isolados) e 2) estirpes dos filogrupos A (n=16) e C (n=2). As estirpes foram afiliadas a 8 clones conhecidos: B2:ST131 (n=7), A:ST58 (n=1), A:ST155 (n=4), C:ST410 (n=2), A:ST453 (n=2), A:ST617 (n=2), A:ST744 (n=1) e A:ST1284 (n=3). Dos 18 GRAs investigados por PCR, 9 foram detectados (i.e. sul1, sul2, sul3, tet(A), tet(B), blaOXA-1-like, aacA4, aacA4-cr and qnrS1). Nenhum GV foi identificado por PCR. Uma elevada diversidade de plasmídeos foi observada e foram obtidos transconjugantes resistentes à cefotaxima para 8 estirpes, em dois dos casos manifestando um fenótipo de multirresistência. Todas as estirpes foram classificadas como citotóxicas (9 significativamente mais citotóxicas que o controlo positivo), 10 em 21 estirpes eram invasivas (particularmente estirpes do grupo B2:ST131) e 10 estirpes seleccionadas eram patogénicas para larvas. Vinte e quatro e 7 das 25 estirpes produziram sideróforos e hemolisinas, respectivamente. Aproximadamente 65% das estirpes testadas formavam biofilmes, 11 das quais em duas condições experimentais. A análise dos genomas identificou GRAs adicionais (e.g. catB3, strA, strB) e vários GV codificantes de toxinas, sideróforos e factores de colonização, adesão e invasão. Quatro das 6 estirpes foram detectadas por cultivo e/ou qPCR após 28 dias de incubação em microcosmos, sendo que os seus fenótipos de resistência permaneceram inalterados. Neste estudo verificou-se que o efluente tratado com radiação UV-C é uma fonte de estirpes de E. coli multirresistentes e/ou virulentas, algumas das quais poderão persistir no sistema aquático recetor. Como tal, a água residual desinfetada com radiação UV pode ainda constituir um perigo para a saúde pública e para a eficácia geral dos antibióticos, comprometendo a sua reutilização. Uma avaliação mais detalhada de estirpes isoladas de outros efluentes de ETARs é urgente para que possamos desenvolver novos tratamentos, ou combinações sinérgicas destes, capazes de reduzir a libertação destas bactérias para o ambiente.