Extracção, purificação e caracterização bioquímica de uma proteinase aspártica de sementes de Sorghum bicolor (L.) Moench

Abstract

As proteinases aspárticas (E.C.3.4.23, APs) são enzimas vacuolares/lisossomais solúveis, com pH óptimo acídico. Estão presentes em fungos, bactérias, vírus, animais e plantas e a percentagem de identidade entre elas é elevada. Entre as mais bem caracterizadas estão a quimosina, a pepsina, a renina e a proteinase de HIV-1. As APs de origem vegetal, as menos estudadas, têm recebido atenção crescente nos últimos anos. Neste trabalho apresentam-se os estudos de extracção, purificação e caracterização de proteinases aspárticas de sementes de sorgo, o 4º cereal mais produzido no mundo e um importante componente de rações para animais. Nos dois primeiros capítulos faz-se uma revisão bibliográfica dos conhecimentos sobre sorgo e proteinases aspárticas de origem vegetal relevantes para o presente estudo. No capítulo 3 descrevem-se os métodos experimentais de extracção, purificação e caracterização usados no trabalho. O quarto capítulo está dividido em dois: na 1ª parte descrevem-se os estudos de extracção e purificação e estabelece-se um protocolo de extracção/purificação; na 2ª parte faz-se a caracterização (relativamente sumária) das enzimas purificadas e comparam-se as suas propriedades com as de APs de monocotiledóneas estudadas por outros investigadores. No quinto e último capítulo apresentam-se as conclusões globais e propõem-se estudos conducentes a um melhor conhecimento da bioquímica das enzimas em causa. As proteinases foram extraídas de sementes em repouso a pH acídico na presença de NaCl 1 M, Triton X-100 e polivinilpirrolidona e purificadas, com um factor de purificação de 100, em dois passos cromatográficos principais – cromatografia de troca iónica, em DEAE Sepharose Fast Flow, e cromatografia de afinidade, em Pepstatin-Agarose. As proteinases purificadas são completamente inibidas por pepstatina A, um inibidor específico de proteinases aspárticas, e têm actividade máxima a pH 3,5 e 45ºC, com hemoglobina como substrato. A actividade é mais elevada a 60ºC do que a 30 ºC. Estudos de SDS-PAGE e native-PAGE revelaram uma enzima monomérica de 29 kDa e uma enzima heterodimérica de 61 kDa, com duas subunidades de 49 e 12 kDa ligadas por pontes dissulfureto. Os pontos isoeléctricos, determinados por focagem isoeléctrica, são 4,91 e 4,95. Estes estudos deram origem a dois artigos científicos; um está publicado e o outro foi submetido para publicação.

Aspartic proteinases (E.C.3.4.23, APs) are vacuolar/lysosomal soluble enzymes with acidic pH-optima. They are highly conserved among species, from fungi, bacteria, viruses and animals to plants. Among the best characterized are chymosin, pepsin, renin and the HIV-1 proteinase. Plant APs, the least studied, have received increasing attention in the past few years. In this work we report studies on the extraction, purification and characterization of the aspartic proteinases from seeds of sorghum, the fourth leading cereal grain produced in the world and a major feed constituent for livestock. In the first two chapters, the literature on relevant aspects of sorghum and plant aspartic proteinases is reviewed. Chapter 3 describes the experimental methods of extraction, purification and characterization used throughout the work. Part 1 of chapter 4 is concerned with the choice of germinating time, the extraction and purification trials and the establishment of an extraction/purification protocol, while part 2 is devoted to the (relatively brief) characterization of the enzymes and to the comparison of their properties with those of other aspartic proteinases of monocotyledonous plants. In the last chapter we present the general conclusions and propose further studies that might contribute to a better knowledge of the biochemistry of these enzymes. The proteinases were extracted from resting seeds at acid pH in the presence of NaCl 1 M, Triton X-100 and polyvinypyrrolidone and purified 100-fold by a two-step purification scheme – ion exchange chromatography, on DEAE Sepharose Fast Flow, and affinity chromatography, on Pepstatin A-Agarose. The purified proteinases are completely inhibited by pepstatin A, a specific inhibitor of aspartic proteinases, and have maximum activity at pH 3.5 and 45 ºC, with hemoglobin as substrate. Activity at 60 ºC is higher than at 30 ºC. SDSPAGE and native-PAGE revealed a monomeric 29-kDa enzyme and a heterodimeric 61-kDa enzyme with two S-S linked subunits of 49 and 12 kDa. The isoelectric points, as determined by isoelectric focusing, are 4.91 and 4.95. These studies gave rise to two scientific articles, one has been published and the other has been submitted for publication.