Toxicity of pesticides to Chironomus riparius: changes in proteome, biochemical biomarkers and individual responses

Abstract

The application of pesticides in agricultural fields leads to inevitable contamination of adjacent freshwater systems, representing a serious threat to non-target aquatic invertebrate communities. The study of the impact of these stressors on ecologically relevant species is crucial for risk assessment. Traditionally, toxicity testing focuses on organism and population-level responses (e.g. mortality, growth, behavior, and reproduction). However, these responses are often preceded by changes at lower levels of biological organization. In this sense, there is a need to develop sensitive tools that can be used to predict ecological adverse effects of sub-lethal concentrations of pesticides. Assessing sub-organismal endpoints may therefore provide early indicators of pesticide exposure and their possible impacts on natural populations. In this thesis, larvae of Chironomus riparius (Meigen) were exposed to four insecticides with distinct modes of action: amitraz, spinosad, indoxacarb, and fipronil, and their effects evaluated in terms of life-history responses using standard laboratory ecotoxicological tests, and at biochemical level by monitoring specific oxidative stress, neuronal, and energy metabolism biomarkers. Moreover, the effects of spinosad, indoxacarb, and fipronil were assessed at the molecular level using proteomic tools, to determine if proteomics and biochemical biomarkers can be used as reliable and sensitive tools in ecological risk assessment. The results presented here indicate that environmentally relevant concentrations of the insecticides tested can significantly affect several C. riparius life-history traits, with reductions in the larval growth and impairment of emergence endpoints observed for all compounds tested, which ought to compromise the ecological integrity of freshwater ecosystems. At the biochemical level, very distinct responses were observed for each pesticide, probably due to their distinct modes of action. Nonetheless, evidences of high metabolic costs (as indicated by the increase of electron transport system (ETS) and/or lactate dehydrogenase (LDH) activities) were observed for all insecticides, which are probably associated with the activation of antioxidant defenses and detoxification processes. Additionally, evidences of oxidative damage were found in C. riparius larvae under exposure to amitraz and spinosad, as indicated by the increase in lipid peroxidation (LPO) levels. At the proteome level, no significant changes were found in C. riparius proteome between exposed and non-exposed larvae for the concentrations of indoxacarb tested. Fipronil exposure induced alterations in the expression of globins, cytoskeleton and motor proteins, as well as in proteins involved in protein synthesis. Exposure to spinosad resulted in alterations in globins, actin, and cuticle proteins’ expression. These changes observed at the proteome level revealed potential mechanisms of action that lead to the effects observed at the individual level. The potential of C. riparius globins expression in environmental monitoring studies has been previously stated and are here sustained. The generalized downregulation of these proteins observed under exposure to spinosad and fipronil may be related to the toxic effects of these insecticides. This study highlights the importance of complementing standard ecotoxicological approaches with biochemical and molecular tools in an integrative manner. The analyses of biochemical biomarkers and of the proteome can be useful in risk assessment, contributing to the knowledge of the sub-lethal effects of pesticides, thus aiding the comprehensive and mechanistically understanding of the mechanisms that lead to higher level responses. It is also demonstrated that the pesticides tested here pose a potential risk to non-target aquatic invertebrates, and therefore their application near freshwater systems should be reviewed. Chironomus riparius, a model organism in aquatic toxicology, is also presented as a promising model organism for environmental proteomics.

O uso de pesticidas em campos agrícolas resulta na inevitável contaminação dos sistemas de água doce adjacentes, representando uma séria ameaça para as comunidades de invertebrados aquáticos não alvo. O estudo do impacto destes compostos em espécies ecologicamente relevantes é crucial para a avaliação de risco. Tradicionalmente, os testes ecotoxicológicos baseiam-se em respostas ao nível do organismo e da população (ex. mortalidade, crescimento, comportamento e reprodução). No entanto, estas respostas observadas ao nível do organismo e população são usualmente precedidas por alterações nos níveis mais baixos de organização biológica. Nesse sentido, existe a necessidade de desenvolver ferramentas sensíveis que possam ser usadas para prever potenciais efeitos adversos ecológicos de concentrações sub-letais de inseticidas. A avaliação de efeitos ao nível subindividual pode assim fornecer informação prévia da exposição a pesticidas e os seus possíveis impactos em populações naturais. Nesta tese, larvas da espécie modelo em ecotoxicologia Chironomus riparius (Meigen) foram expostas a quatro inseticidas com diferentes modos de ação: amitraz, spinosad, indoxacarb e fipronil, e os seus efeitos avaliados em termos de respostas do ciclo de vida utilizando testes ecotoxicológicos padronizados, e ao nível bioquímico monitorizando biomarcadores específicos de stress oxidativo, neurotoxicidade e metabolismo energético. Além disso, os efeitos do spinosad, indoxacarb e fipronil ao nível molecular foram avaliados usando ferramentas de proteómica, com o objetivo de determinar se a proteómica e os marcadores bioquímicos podem ser ferramentas sensíveis na avaliação de risco ecológico. Os resultados aqui apresentados indicam que concentrações ambientalmente relevantes dos pesticidas testados, podem comprometer significativamente vários indicadores do ciclo de vida de C. riparius. Foram observadas reduções no crescimento larval e alterações nos parâmetros relacionados com a emergência dos insectos em resposta à exposição a todos os inseticidas testados, o que pode comprometer a integridade ecológica dos ecossistemas de água doce. Ao nível bioquímico, foram observadas respostas muito distintas para cada pesticida, provavelmente devido aos seus diferentes modos de ação. No entanto, foram observados indícios de elevados custos metabólicos (indicados pelo aumento das atividades da cadeia transportadora de eletrões (ETS) e/ou da enzima lactato desidrogenase (LDH) para todos os inseticidas. Estes aumentos estão provavelmente relacionados com a ativação de mecanismos de defesa antioxidantes e de processos de destoxificação. Além disso, foram observados indícios de dano oxidativo em larvas expostas a amitraz e spinosad, indicado pelo aumento nos níveis de peroxidação lipídica (LPO). Ao nível do proteoma, não foram observadas alterações significativas nas larvas expostas a indoxacarb em comparação com larvas não expostas. A exposição ao fipronil causou alterações na expressão de globinas, de proteínas motoras e do citoesqueleto, bem como em proteínas envolvidas na síntese proteica. A exposição ao spinosad resultou em alterações na expressão de globinas, actinas e de proteínas da cutícula. Estas alterações observadas ao nível do proteoma revelaram potenciais mecanismos de ação que levam aos efeitos observados ao nível do organismo. O potencial da expressão das globinas de C. riparius em estudos de monitorização ambiental foi previamente afirmado e é aqui sustentado. O decréscimo generalizado observado na expressão destas proteínas sob exposição ao spinosad e ao fipronil pode estar relacionado com os efeitos tóxicos destes inseticidas. Esta tese destaca a importância de complementar de uma forma integrada os ensaios ecotoxicológicos padronizados com ferramentas bioquímicas e moleculares. A análise de marcadores bioquímicos e do proteoma pode ser útil na avaliação de risco, contribuindo para o conhecimento dos efeitos sub-letais dos pesticidas, auxiliando na compreensão dos mecanismos que conduzem às respostas observadas nos níveis mais elevados de organização biológica. Este estudo revela também que os pesticidas testados representam um risco para os invertebrados aquáticos não alvo, e, portanto, a sua aplicação próxima de sistemas de água doce deve ser revista. Chironomus riparius, um organismo modelo em toxicologia aquática, é também aqui apresentando como um modelo promissor em estudos de proteómica ambiental.