Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10773/26081
Title: Effects of gold nanoparticles on Sparus aurata
Other Titles: Estudo do efeito de nanopartículas de ouro em Sparus aurata
Author: Barreto, Ângela Maria Almeida
Advisor: Oliveira, Marcelino Miguel Guedes de Jesus
Loureiro, Susana Patrícia Mendes
Hylland, Ketil
Keywords: Gold nanoparticles
Gemfibrozil
Combined exposures
Sparus aurata
In vivo
In vitro
Behaviour
Oxidative stress
Oxidative damage
Genotoxicity
Proteome
Issue Date: 30-Nov-2018
Abstract: Estuarine and coastal areas are the ultimate recipient for most contaminants, including emerging contaminants of concern such as nanoparticles (NPs) and pharmaceuticals. Gold nanoparticles (AuNPs) are used for a wide range of applications and have the potential to be extensively released into the environment. One of the fundamental requirements for the wide use of AuNPs is their presumed non-toxic and biocompatible nature, but recent studies have highlighted their possible toxicity, including oxidative stress, genotoxicity and protein modifications. These findings raise concerns about the potential impact of AuNPs on aquatic organisms and ultimately on human health. Considering the conflicting information about the toxicity of AuNPs, the relevance of their characteristics on the induced effects and the limited knowledge pertaining to any effects on marine/estuarine fish species, this thesis aimed to answer this general question: Will exposure to AuNPs affect molecular, biochemical and behavioural responses of Sparus aurata? To answer this general question, in vitro (24 h liver organ culture) and in vivo (96 h of exposure) assays were performed testing 7 and 40 nm AuNPs with either citrate or polyvinylpyrrolidone (PVP) coating, alone and combined with the pharmaceutical gemfibrozil (GEM). Tested concentrations ranged from 4 to 7200 μg.L-1 and 4 to 1600 μg.L-1 in the in vitro and in vivo assays, respectively. In vitro, oxidative stress/damage and biotransformation responses as well as genotoxicity were evaluated. In vivo, effects at different levels of biological organization (behaviour, neurotransmission, biotransformation, oxidative stress/damage, genotoxicity and proteins alterations) were evaluated. In cell culture media, the size of all tested AuNPs was altered within 12 h of incubation with the formation of aggregates/agglomerates larger than 100 nm. Aggregates/agglomerates of 7 nm polyvinylpyrrolidone coated gold nanoparticles (PVP-AuNPs) had smaller sizes and induced more effects than 7 nm citrate coated gold nanoparticles (cAuNPs) and 40 nm AuNPs. The results from S. aurata liver organ culture assays showed that AuNPs induced catalase (CAT) and glutathione reductase (GR) activities, DNA strand breaks and lipid peroxidation (LPO). In seawater, 7 nm cAuNPs, almost immediately aggregated/agglomerated and increased their sizes (160 nm), inducing more effects on S. aurata than PVP-AuNPs (7 and 40 nm), despite PVP-AuNPs observed stability. Also, 7 nm cAuNPs induced more effects than 40 nm cAuNPs which formed agglomerates/aggregates of 340 nm in seawater. In vivo, gold accumulation in S. aurata gills, liver and spleen was higher than in muscle. The observed gold accumulation was dependent on the characteristics of AuNPs, mostly on the coating, with higher accumulation after exposure to PVP-AuNPs compared to cAuNPs. Overall, induction of enzymatic (e.g. CAT, GR, glutathione peroxidase (GPx) and glutathione S-transferases (GST)) and non-enzymatic (non-protein thiols – NPT) defences was found after in vivo exposure to AuNPs, both in gills and liver. Decreased ability of S. aurata to continue swimming against a water flow, which can be considered an ecologically relevant effect of NPs exposure, was observed after 96 h AuNPs exposure. Gills and liver oxidative damage (increased LPO levels) and increased erythrocytes DNA strand breaks and frequency of nuclear abnormalities were detected after AuNPs in vivo exposure. AuNPs also induced alterations in the abundance of S. aurata liver proteins, with 7 nm cAuNPs inducing more effects than 7 nm PVP-AuNPs and 40 nm AuNPs. The analysis of the tissues responses showed that the gills of S. aurata were more sensitive than the liver, both in the single and combined exposures to AuNPs. In the in vitro and in vivo experiments, the assessment of the combined effects of AuNPs (7 or 40 nm) and GEM showed that the predicted percentages of effect (the sum of the percentage of the single exposures) were, for most of the tested endpoints, different than the observed percentages of effect, representing possible antagonistic (e.g. erythrocytic nuclear abnormalities and DNA damage) or synergistic (e.g. hepatic CAT and GR activities for 40 nm AuNPs with GEM and gills NPT content for 7 nm AuNPs with GEM) patterns. Overall, the effects of exposure to AuNPs depended on the concentration, size and coating of NPs and the presence of other contaminants. Data from the in vitro and the in vivo assays showed that the smaller AuNPs (7 nm) induced more alterations and, in terms of coating, assay specific responses were found, with PVP and citrate coating AuNPs being more biologically active in the in vitro and in vivo assay, respectively. The results showed that AuNPs are not inert, even at low concentrations as 4 μg.L-1, raising concern about its safety for use in aquaculture, biomedical applications or other areas. The findings showed that the multiparametric approach used in this thesis, integrating the evaluation of the in vivo effects of behavioural and oxidative stress/damage biomarkers, genotoxicity and proteins alterations, together with NPs characterisation and bioaccumulation, was essential to increase the knowledge about the toxicity of NPs to marine fish species. Addittionally, the liver organ culture of S. aurata was sensitive to low concentrations of the tested contaminants and could be used to differentiate responses to AuNPs with different characteristics, supporting its use as an alternative to in vivo testing
As áreas estuarinas e costeiras são o receptor final para muitos contaminantes, incluindo contaminantes emergentes como as nanopartículas (NPs) e os fármacos. As nanopartículas de ouro (AuNPs) são usadas numa ampla gama de aplicações, podendo ser libertadas para o ambiente. Um dos requisitos fundamentais para o vasto uso das AuNPs é a sua presumível natureza não tóxica e biocompatível, embora estudos recentes tenham mostrado a sua possível toxicidade, incluindo stress oxidativo, genotoxicidade e alterações em proteínas. Estes resultados levantam preocupações acerca do impacto das AuNPs em organismos aquáticos e para a saúde humana. Tendo em conta a informação contraditória acerca da toxicidade das AuNPs, a importância das suas características nos efeitos produzidos e o conhecimento limitado acerca dos seus efeitos em espécies de peixe marinhas/estuarinas, esta tese teve como objetivo responder à pergunta geral: Irá a exposição a AuNPs afetar respostas moleculares, bioquímicas e comportamentais da dourada (Sparus aurata)? Para responder a esta questão, foram realizados ensaios in vitro (24 h; culturas de fígado) e in vivo (96 h de exposição) testando AuNPs de 7 e 40 nm, revestidas com citrato ou polivinilpirrolidona (PVP), individualmente e combinadas com o fármaco gemfibrozil (GEM). As gamas de concentrações testadas variaram entre 4 a 7200 μg.L-1 e 4 a 1600 μg.L-1 nos ensaios in vitro e in vivo, respetivamente. Na exposição in vitro, foram avaliados parâmetros de stress/dano oxidativo, biotransformação e genotoxicidade. In vivo, foram avaliados efeitos a diferentes níveis de organização biológica (comportamento, neurotransmissão, biotransformação, stress/dano oxidativo, genotoxicidade e alteração em proteínas). Em meio de cultura, o tamanho das AuNPs testadas alterou-se nas primeiras 12 h de incubação com a formação de agregados/aglomerados maiores que 100 nm. Os agregados/aglomerados das nanopartículas de ouro de 7 nm revestidas com polivinilpirrolidona (PVP-AuNPs) apresentaram tamanhos menores e induziram mais efeitos do que as nanopartículas de 7 nm revestidas com citrato (cAuNPs) e as AuNPs de 40 nm. Os resultados dos ensaios com culturas de fígado mostraram que as AuNPs têm a capacidade de induzir as atividades da catalase (CAT) e glutationa redutase (GR), induzir quebras na cadeia de ADN e peroxidação lipídica (LPO). Em água salgada, as cAuNPs de 7 nm, quase imediatamente agregaram/aglomeraram e aumentaram o seu tamanho (aggregados/aglomerados de 160 nm), induzindo mais efeitos em S. aurata do que as de PVP-AuNPs (7 e 40 nm), apesar da estabilidade das PVP-AuNPs neste meio. As cAuNPs de 7 nm causaram também mais efeitos do que as cAuNPs de 40 nm que formaram agregados/aglomerados de 340 nm em água salgada. In vivo, a acumulação de ouro nas brânquias, fígado e baço da dourada foi maior do que no músculo. A acumulação de ouro nos tecidos foi dependente das características das AuNPs, principalmente com o revestimento, verificando-se uma maior acumulação de ouro após exposição a PVP-AuNPs (comparando com cAuNPs). De um modo geral, a indução das defesas enzimáticas (CAT, GR, glutationa peroxidase (GPx) e glutationa S-transferases (GST)) e não enzimáticas (tióis não proteicos (NPT)) foi detetada depois da exposição in vivo a AuNPs, nas brânquias e fígado. A diminuição da capacidade natatória da dourada face a um fluxo de água constante foi observada após 96 h de exposição às AuNPs, o que pode ser considerado um efeito ecológico relevante após exposição a NPs. Dano oxidativo nas brânquias e fígado (níveis de LPO aumentados), aumento das quebras na cadeia de ADN e da frequência de anomalias nucleares nos eritrócitos foram detetados depois da exposição in vivo às AuNPs. As AuNPs induziram também alterações na abundância de proteínas presentes no fígado da dourada, com cAuNPs de 7 nm induzindo mais efeitos que as PVP-AuNPs de 7 nm e as AuNPs de 40 nm. A análise das respostas por tecido mostrou que as brânquias da dourada foram mais sensíveis do que o fígado, nas exposições às AuNPs (individuais e em combinação com o fármaco). Nos ensaios in vitro e in vivo, a avaliação dos efeitos combinados das AuNPs (7 ou 40 nm) e GEM mostrou que as percentagens esperadas de efeito (a soma da percentagem das exposições individuais) foram, para a maioria dos parâmetros avaliados, diferentes das percentagens de efeito observadas, representando possíveis padrões antagonistas – no caso das anomalias nucleares e dano no ADN dos eritrócitos, ou sinergistas – nas atividades da CAT e GR no fígado depois da exposição às AuNPs de 40 nm com o GEM e níveis de NPT nas brânquias depois da exposição às AuNPs de 7 nm com o GEM. De uma forma geral, os efeitos da exposição a AuNPs dependeu da concentração, tamanho e revestimento das NPs e da presença de outros contaminantes. Os resultados dos ensaios in vitro e in vivo mostraram que as AuNPs de tamanho menor (7 nm) induziram mais alterações e, em termos de revestimento, foram encontradas respostas específicas em cada ensaio, com o revestimento PVP e citrato a ser mais biologicamente ativo no ensaio in vitro e in vivo, respetivamente. Os resultados mostraram que as AuNPs não são inertes, mesmo a concentrações baixas como 4 μg.L-1, levantando preocupações acerca da segurança do seu uso em aquacultura, aplicações biomédicas ou outras áreas. Os resultados mostraram que a abordagem multiparamétrica usada nesta tese, integrando a avaliação de efeitos in vivo de biomarcadores comportamentais e de stress/dano oxidativo, genotoxicidade e alterações proteícas, juntamente com a caracterização e bioacumulação de NPs, foi essencial para aumentar o conhecimento acerca da toxicidade das NPs para espécies de peixe marinhas. Adicionalmente, as culturas de fígado foram sensíveis a concentrações baixas dos contaminantes testados e permitiu diferenciar as respostas a AuNPs com diferentes características, realçando o seu uso como alternativa aos testes in vivo.
URI: http://hdl.handle.net/10773/26081
Appears in Collections:DBio - Teses de doutoramento
UA - Teses de doutoramento

Files in This Item:
File Description SizeFormat 
Documento.pdf5.74 MBAdobe PDFembargoedAccess


FacebookTwitterLinkedIn
Formato BibTex MendeleyEndnote Degois 

Items in DSpace are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.