Estudos estruturais da cortiça e seus constituintes: aplicação de técnicas espectroscópicas e análise química

Abstract

O presente trabalho propõe-se contribuir para a caracterização química e estrutural da cortiça e seus constituintes, por meio da aplicação de técnicas espectroscópicas e de análise química. Destaca-se a espectroscopia de RMN do estado sólido como técnica fundamental na caracterização nãodestrutiva da estrutura e dinâmica molecular das paredes celulares da cortiça. O Capítulo I resume o conhecimento sobre a composição e estrutura química da cortiça e seus constituintes, existente até à presente data, documentada através de uma extensa revisão bibliográfica que abrange cerca de uma centena de publicações. O Capítulo II descreve de uma forma resumida os fundamentos e os métodos de espectroscopia de RMN do estado sólido, em particular a teoria subjacente às experiências de observação de 1H e 13C realizadas no presente trabalho. O Capítulo III começa por descrever a composição química da cortiça utilizada ao longo deste trabalho e depois desenvolve a caracterização estrutural das paredes celulares da cortiça por métodos não-destrutivos. As medições dos tempos de relaxação de spin permitiram identificar uma matriz de lenhina e polissacarídeos nas paredes celulares da cortiça, que apresenta mobilidade molecular restrita e se encontra espacialmente segregada da suberina alifática. Esta, por sua vez, está organizada em duas fracções com propriedades dinâmicas distintas. Cerca de 90% da suberina caracteriza-se por ter maior mobilidade molecular e está associada a estruturas aromáticas relativamente móveis. A restante fracção da suberina (10%) encontra-se na interface junto aos polissacarídeos da matriz lenhocelulósica, exibindo maiores restrições de mobilidade. Os dados de difracção de raios-X revelam aqui pela primeira vez que uma fracção da suberina se encontra organizada numa forma cristalina nas paredes celulares da cortiça. Neste capítulo, apresentam-se ainda os primeiros espectros de cortiça de RMN MAS de 1H de alta resolução, obtidos com uma frequência de rotação de 32 kHz e uma sequência de eco de spin antes da aquisição. O Capítulo IV surge na continuidade do Capítulo anterior, pois desenvolve o estudo da caracterização estrutural e quantificação espectroscópica da suberina nas paredes celulares da cortiça. Verifica-se que a remoção das cadeias alifáticas de suberina por metanólise alcalina se inicia na interface com os polissacarídeos e é posteriormente acompanhada pela remoção de estruturas aromáticas. A dinâmica e a organização molecular dos restantes componentes na cortiça é significativamente afectada pela remoção de suberina, mesmo em pequenas quantidades. A remoção completa da suberina origina um sistema mais rígido e denso, que traduz uma maior proximidade entre a lenhina e os polissacarídeos nas paredes celulares. Neste Capítulo, apresentam-se ainda três métodos para estimar o teor de suberina na cortiça por espectroscopia de CP/MAS e de FTIR-PAS, aliadas a métodos de análise multivariada. Estes métodos constituem uma alternativa ao método moroso e destrutivo de extracção da suberina e posterior quantificação gravimétrica. O Capítulo V descreve a caracterização química dos extractos de suberina da cortiça. Os extractos são analisados por VPO e espectroscopia de RMN, e a sua composição monomérica é determinada por GC-MS. Verifica-se que uma fracção dos extractos (70%) é constituída por estruturas de elevada massa molecular, designadamente cadeias alifáticas ainda esterificadas e estruturas aromáticas condensadas. Verificou-se ainda que os ácidos ωhidroxi-alcanóicos e alcanodióicos saturados, 1-alcanóis e ácidos alcanóicos são removidos preferencialmente na fase inicial da metanólise alcalina, sugerindo que se encontram preferencialmente na interface da suberina com os polissacarídeos nas paredes celulares da cortiça. O Capítulo VI descreve o estudo das interacções entre a suberina e os restantes componentes poliméricos da cortiça. Verificou-se que sempre que se procede ao isolamento da lenhina-dioxano da cortiça, esta contém invariavelmente resíduos de cadeias alifáticas de suberina. Por outro lado, todos os extractos de suberina contêm estruturas aromáticas. Com o objectivo de caracterizar estas duas fracções aromáticas e detectar eventuais diferenças estruturais procedeu-se à sua caracterização por oxidação com permanganato. Os resultados indicam que a lenhina é essencialmente do tipo guaiacilo, embora bastante mais condensada e com mais unidades siringilo do que a fracção aromática associada à suberina, constituída essencialmente por ácido ferúlico. As interacções entre a suberina e os polissacarídeos foram estudadas através da caracterização espectroscópica e química de um resíduo isolado da cortiça contendo unicamente estes dois componentes. Os resultados indicam que existem ácidos ω-hidroxi-alcanóicos saturados e 1-alcanóis ligados à celulose e xilanas por ligações éter. Por fim, o Capítulo VII inclui um estudo da variabilidade da cortiça amadia proveniente do Sul de Portugal, desenvolvido por técnicas espectroscópicas (RMN e FTIR) combinadas com métodos de análise multivariada. Nas Conclusões Finais apresenta-se uma visão integrada e relacionada de todos os dados experimentais, permitindo propor um modelo mais detalhado para a organização dos constituintes químicos nas paredes celulares da cortiça.

The aim of the present work is to contribute to the knowledge of the chemistry and structure of cork and its constituents, through the application of spectroscopic techniques and chemical analysis. Emphasis is given to solid state NMR spectroscopy as a fundamental technique in the nondestructive characterisation of cork cell walls structure and molecular dynamics. Chapter I summarises the knowledge on the structure and chemical composition of cork and its constituents up to this date, documented through an extensive bibliographic revision which includes about one hundred publications. Chapter II shortly describes the fundamentals and methods of solid state NMR spectroscopy, in particular the theory underlying the 1H and 13C NMR experiments that were made on this work. Chapter III starts to present the chemical composition of cork used through this study and then describes the structural characterisation of cork cell walls by non-destructive methods. The spin relaxation time measurements allowed the identification of a lignin and carbohydrate matrix in cork cell walls, which presents restricted molecular mobility and is spatially segregated from aliphatic suberin. The aliphatic suberin is organised in two fractions with distinct dynamic properties. About 90% of suberin have more motional freedom and is associated to relatively mobile aromatic structures. The remaining suberin fraction (10%) is in the interface with the carbohydrates, exhibiting restricted mobility. The X-ray diffraction data enable here for the first time to detect a suberin fraction that is organised in a crystalline fashion in cork cell walls. In this Chapter, high-resolution 1H MAS NMR spectra of cork, using MAS frequencies of 32 kHz in tandem with delayed spin echo acquisition, is presented here. Chapter IV continues the discussion of spin relaxation measurements, but now reported to the structural characterisation of suberin in cork cell walls with different degrees of desuberisation. Results show that the removal of suberin aliphatic chains by alkaline methanolysis starts at the interface with the carbohydrates. Aromatic structures are also removed with aliphatic suberin. The molecular organisation and dynamics of the remaining cork components are significantly affected by the removal of even small quantities of suberin. The complete removal of suberin leads to a rigid and dense system. This Chapter also introduces three methods to estimate the suberin content in cork by CP/MAS and FTIR-PAS spectroscopy, combined with multivariate analysis. These methods are an attractive alternative to the destructive and time consuming method of suberin extraction followed by gravimetric quantification. Chapter V describes the chemical characterisation of cork suberin extracts. The extracts are characterised by VPO and NMR spectroscopy and their monomeric composition is determined by GC-MS. Results show that a large fraction of the extracts (70%) is composed of high molecular weight structures, namely estherified aliphatic chains and aromatic condensed structures. It was shown that saturated ω-hydroxy-alkanoic and alkanedioic acids, 1-alcanols and alkanoic acids are preferentially removed in the first stage of alkaline methanolysis, suggesting that these monomers are preferentially located in the interface of suberina and carbohydrates in cork cell walls. Chapter VI describes the interactions between suberin and other polymeric components of cork. Therefore, dioxan-lignin was isolated from cork and characterised by permanganate oxidation in order to establish the differences with the aromatic fraction in suberin extracts. Results show that lignin is much more condensed and contains more syringilpropane units than the aromatic fraction associated with suberin, possible derived from ferulic acid. The interactions between suberin and the carbohydrates are studied through the spectroscopic and chemical characterisation of a residue isolated from cork by an organosolv method, containing only these two components. Results show the existence of saturated ω-hydroxyalkanoic acids and 1-alcanols linked to cellulose and xylans by ether linkages. Lastly, Chapter VII includes a study on the variability of reproduction cork from the South of Portugal, using spectroscopic techniques (NMR and FTIRPAS) combined with multivariate analysis. This Chapter also describes the application of the multivariate models introduced in Chapter IV, used for spectroscopic quantification of suberin, to estimate the variability of the suberin content in Portuguese cork. The Final Conclusions present an integrated and related view of all the experimental data, allowing the proposal of a more detailed model to describe the organisation of the chemical constituents in cork cell walls.