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Title: Construção de uma biblioteca genómica de Debaryomyces hansenii e pesquisa do gene URA3 por técnicas de complementação
Author: Santos, Susana Maria Henriques Domingos da Costa
Advisor: Gírio, Francisco Manuel Ferreira
Defense Date: 2001
Abstract: Diversos estudos demonstraram que Debaryomyces hansenii é uma potencial hiperprodutora de xilitol, o que transforma esta levedura num microrganismo elegível para a produção de xilitol por via biológica. O desenvolvimento da levedura Debaryomyces hansenii como um sistema de transformação poderá contribuir para um importante sistema de clonagem e manipulação de genes. Os sistemas de transformação baseados em genes URA3 são muito importantes em Saccharomyces cerevisiae e outras leveduras. O presente trabalho de tese teve como objectivo central a construção de uma bibliotca genómica de Debaryomyces hansenii e a pesquisa do gene URA3, utilizando técnicas de complementação. Assim, procedeu-se à extracção e purificação de ADN da levedura Debaryomyces hansenii e à construção de uma biblioteca de ADN genómico no vector pUC18. Efectuaram-se ensaios de complementação de Escherichia coli ura-, com a biblioteca genómica construída, pesquisaram-se os clones transformantes Ura+ cultiváveis em meio selectivo e caracterizaram-se os plasmídeos recombinantes o que conduziu à identificação de um clone, que posteriormente se verificou ter perdido a capacidade de complementação da mutação pyrF74 : : tn5 de E. coli. Simultaneamente, realizaram-se testes de complementação de Saccharomyces cerevisiae ura- por subclonagem do fragmento pUra+ em vector “shuttle” de leveduras e selecção de clones positivos em meio selectivo. Este ensaio não produziu resultados positivos. A continuação deste trabalho prossegue com a insistente pesquisa do gene URA3 por técnicas de complementação.
Diferent studies had demonstrated relevant production of xylitol by Debaryomyces hansenii, which showed to be an important xylitol biological producer. In this way, the development of the yeast Debaryomyces hansenii as a transformation system, can contribute to an important system for gene cloning and manipulation. Transformation systems based on URA3 genes are very powerful in Saccharomyces cerevisiae and other yeasts. The present work of thesis had as main aim the construction of a genomic library from the yeast Debaryomyces hansenii and the search of URA3 gene by employing complementation techniques. Desoxyribonucleic acid from Debaryomyces hansenii was extracted and purified and a genomic DNA library was constructed into the vector pUC18. Complementation assays of the bacteria Escherichia coli Ura- with the genomic library constructed were done. Transformants Ura+ were screened in selective medium. Recombinants plasmids were isolated and characterized which led to the identification of one clone, that after was confirmed have lost the ability to complement the E. coli pyrF74 : : tn5 mutation. Simultaneously it was carried out complementation tests of the yeast Saccharomices cerevisiae ura- by subcloning of the pUra+ fragments into yeasts shuttle vectors and the positive clones were selected by cultivation in selective medium. This assay did not have positive results. This work will proceed on insisting the search of URA3 gene by complementation techniques.
URI: http://hdl.handle.net/10773/25959
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